如何用注射器卡盒在酶標(biāo)儀上進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（DLR）
雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(DLR)是研究真核生物基因表達(dá)的有力工具。實(shí)驗(yàn)涉及將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，一種包含目的基因的啟動(dòng)子，另一種包含質(zhì)控基因的啟動(dòng)子。螢火蟲和海腎熒光素酶的生物發(fā)光報(bào)告系統(tǒng)因其易操作性和高靈敏度而廣泛應(yīng)用，Promega公司的雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)允許在單個(gè)微孔板孔中同時(shí)檢測(cè)兩種酶的活性。實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)便，無(wú)需額外處理，易于在SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀的注射器卡盒上完成。
實(shí)驗(yàn)所需材料包括雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)、CHO-K1細(xì)胞、Fugene高效轉(zhuǎn)染試劑、6孔組織培養(yǎng)板、96孔平底底透白色TC處理板、光學(xué)放大的封膜、白色96和384孔微孔板、SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機(jī)和SpectraMax注射器卡盒。實(shí)驗(yàn)方法分為酶標(biāo)準(zhǔn)曲線和基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)兩部分。酶標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)配制螢火蟲和海腎熒光素酶的工作液和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行，同時(shí)準(zhǔn)備雙熒光素酶檢測(cè)試劑，用于沖洗注射器卡盒并進(jìn)行加液操作。
基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，將CHO-K1細(xì)胞接種于6孔板并在隔夜培養(yǎng)，接著進(jìn)行瞬轉(zhuǎn)pGL4.13 [luc2/SV40] 和 pGL4.74 [hRluc/TK] 質(zhì)粒，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔平底底透白色TC處理板中，調(diào)整細(xì)胞密度，進(jìn)行裂解，并結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和SpectraMax i3x讀板機(jī)的注射器卡盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，使用白色封膜提高檢測(cè)信號(hào)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，螢火蟲和海腎熒光素酶的信號(hào)均能達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍，從1.6 fM到1.6 nM，96孔板的檢測(cè)范圍為1 fg每孔到1 ng每孔，384孔板為0.5 fg到0.5 ng每孔。這兩種系統(tǒng)展現(xiàn)出穩(wěn)定性和相似的線性度，表明雙熒光素酶系統(tǒng)與SpectraMax i3x系統(tǒng)相兼容。
實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了螢火蟲和海腎熒光素酶在不同細(xì)胞密度下的線性度，結(jié)果顯示，兩種酶的化學(xué)發(fā)光信號(hào)差異源于轉(zhuǎn)染細(xì)胞中螢火蟲與海腎質(zhì)粒的比例和啟動(dòng)子能力的差異。通過(guò)將螢火蟲熒光素酶RLU值均一化到海腎熒光素酶RLU值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在不同細(xì)胞密度梯度中保持一致。
綜上所述，雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)和SpectraMax i3x系統(tǒng)的結(jié)合提供了高度敏感性和動(dòng)態(tài)范圍的檢測(cè)能力，即使在熒光素酶表達(dá)量和細(xì)胞密度存在顯著差異的情況下，仍能準(zhǔn)確檢測(cè)熒光素酶信號(hào)。SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機(jī)的制冷PMT檢測(cè)器可以有效降低背景信號(hào)，提高實(shí)驗(yàn)靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍。通過(guò)SoftMax Pro軟件預(yù)設(shè)的模板進(jìn)行快速分析和結(jié)果均一化，使得數(shù)據(jù)分析變得便捷。
前味15565424299： 酶標(biāo)儀 細(xì)胞計(jì)數(shù) -
北戴河區(qū)嚙入： ______ 1.酶標(biāo)儀只能進(jìn)行相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)(同一狀態(tài)的細(xì)胞用MTT染色或者其他染色,染色后的吸光度值和細(xì)胞數(shù)成正比),要計(jì)絕對(duì)數(shù)可以用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板. 2.單孔多點(diǎn)掃描的作用:在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)同一孔進(jìn)行掃描,一般這類酶標(biāo)儀具有孵育器,適合于檢測(cè)細(xì)胞的各種指標(biāo);他與單孔多波長(zhǎng)掃描的不同在于,后者是可以對(duì)同一孔進(jìn)行多個(gè)波段的掃描.THERMOVarioskan Flash這個(gè)酶標(biāo)儀同時(shí)具有這2種功能. 3.酶標(biāo)儀當(dāng)然可以做定性分析了!定性試驗(yàn)一般要求對(duì)閾值進(jìn)行設(shè)置,定量一般則不做要求;定性試驗(yàn)一般不需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行設(shè)置,而定量則需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行設(shè)置.定性實(shí)驗(yàn)得到的是定性結(jié)果,一般有3種可能,在閥值上下限內(nèi),大于閥值上限或小于閥值下限.
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北戴河區(qū)嚙入： ______ 孕期乳房護(hù)理是保證母乳喂養(yǎng)的關(guān)鍵 孕媽咪的主訴:“我?guī)缀跻颜J(rèn)不出這是我的乳房了,變得那么大而且稍微碰一下就感覺(jué)到痛.” “我的胸部本來(lái)比較平,曾經(jīng)想過(guò)隆乳,現(xiàn)在懷了孕突然乳房自己變大了.起初蠻高興的,但是仔細(xì)查看后卻...
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北戴河區(qū)嚙入： ______ 注射器沒(méi)法安裝進(jìn)出油口,可以做個(gè)鋁合金筒體的,在兩側(cè)的端蓋上設(shè)油口,市面上最小也是m10x1的.
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北戴河區(qū)嚙入： ______ 1.加墨水,加墨水分兩次,第一次加50%墨水,因?yàn)樵诤竺娌襟E中墨水太多的話,墨水會(huì)流入到注射器中. 2.抽空氣,在這里有兩種情況,a:墨盒有專門抽墨孔.b:墨盒無(wú)專門抽墨孔.下面分別介紹. a.墨盒有專門抽墨孔.將注射器插在抽...
前味15565424299： 酶標(biāo)儀一般的單位使用是否需要計(jì)量檢定? -
北戴河區(qū)嚙入： ______ 【酶標(biāo)儀是國(guó)家規(guī)定的強(qiáng)制計(jì)量檢定儀器】根據(jù)《中華人民共和國(guó)計(jì)量法》第九條之規(guī)定,縣級(jí)以上人民政府計(jì)量行政部門對(duì)社會(huì)公用計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)器具,部門和企業(yè),事業(yè)單位使用的最高計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)器具,以及用于貿(mào)易結(jié)算,安全防護(hù),醫(yī)療衛(wèi)生,...
前味15565424299： 如何使用熔點(diǎn)儀測(cè)熔點(diǎn) -
北戴河區(qū)嚙入： ______ 使用前的準(zhǔn)備工作 注意:進(jìn)入正式測(cè)試前,必須進(jìn)行使用前的準(zhǔn)備工作. 1.硅油的灌入 用注射器(附件)吸取硅油(附件)10ml從溢出口注入,重復(fù)6次,共需注入60ml硅油,然后將溢油瓶套在溢出口上(如長(zhǎng)期測(cè)量熔點(diǎn)低于90℃時(shí),可用蒸...
前味15565424299： 藥物PG是什么?怎么配皮試? -
北戴河區(qū)嚙入： ______ PG一般指的是青霉素, 青霉素皮試 (8分鐘) 一.評(píng)估 1. 病人病情,年齡,意識(shí)狀態(tài); 2. 有無(wú)過(guò)敏史: ① 有無(wú)使用過(guò)青霉素,什么時(shí)候用過(guò); ② 有無(wú)對(duì)青霉素過(guò)敏; ③ 有無(wú)其他藥物過(guò)敏史,食物過(guò)敏; ④ 有無(wú)對(duì)酒精過(guò)敏; ⑤ 家屬有無(wú)藥物...
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北戴河區(qū)嚙入： ______ 1、打開前蓋.取出硒鼓單元和墨粉盒組件. 2、按下綠色鎖桿并將墨粉盒從硒鼓單元中取出. 3、裝入新鼓后,需要進(jìn)行計(jì)數(shù)重置,按下白色的Go按鈕4 秒以上,直到所有指示燈亮起.四個(gè)指示燈全部亮起時(shí),松開Go按鈕,(僅更換硒鼓單元時(shí), ...
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基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，將CHO-K1細(xì)胞接種于6孔板并在隔夜培養(yǎng)，接著進(jìn)行瞬轉(zhuǎn)pGL4.13 [luc2/SV40] 和 pGL4.74 [hRluc/TK] 質(zhì)粒，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔平底底透白色TC處理板中，調(diào)整細(xì)胞密度，進(jìn)行裂解，并結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和SpectraMax i3x讀板機(jī)的注射器卡盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，使用白色封膜提高檢測(cè)信號(hào)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，螢火蟲和海腎熒光素酶的信號(hào)均能達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍，從1.6 fM到1.6 nM，96孔板的檢測(cè)范圍為1 fg每孔到1 ng每孔，384孔板為0.5 fg到0.5 ng每孔。這兩種系統(tǒng)展現(xiàn)出穩(wěn)定性和相似的線性度，表明雙熒光素酶系統(tǒng)與SpectraMax i3x系統(tǒng)相兼容。
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酶標(biāo)儀上filter是啥意思,雙熒光素酶
題主是否想詢問(wèn)“酶標(biāo)儀上filter是啥意思，雙熒光素酶又是什么”？濾波片，蛋白。1、酶標(biāo)儀上的filter的意思是濾波片，即用于濾光的片狀元件。2、雙熒光素酶是一種分子量較小的蛋白，其可催化熒光素氧化成氧化熒光素。
熒光素酶干貨系列② | 【應(yīng)用篇】 miRNA與靶基因互作研究
漢恒生物的psi-CHECK2載體采用了雙螢光素酶系統(tǒng)，其中海腎螢光素酶用于檢測(cè)，螢火蟲螢光素酶作為內(nèi)參。將研究的靶點(diǎn)序列插入載體3’UTR，與miRNA的mimics共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)。結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具如Targetscan、Starbase，預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)。合成miRNA mimics，擴(kuò)增目的片段，構(gòu)建載體，設(shè)置轉(zhuǎn)染組別，驗(yàn)證miRNA...
什么是熒光素酶基因和綠色熒光蛋白基因?
熒光素酶是生物體內(nèi)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱。由于熒光素酶檢測(cè)簡(jiǎn)便、靈敏、快速，因此目前熒光素酶基因在基因工程方面已成為廣泛使用的報(bào)告基因，具有檢測(cè)靈敏度高，沒(méi)有信號(hào)背景，并且不損害植物的優(yōu)點(diǎn)。來(lái)自維多利亞水母的綠色熒光蛋白（green：fluorescent：protein，GFP）是一種由238個(gè)...
光毒性和細(xì)胞毒性的區(qū)別
其它酶方法：如檢測(cè)上清中堿性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等 細(xì)胞增殖能力分析試劑盒 原理：正常細(xì)胞代謝旺盛，其線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶，可將四唑鹽類物質(zhì)（如 MTT、XTT、WST-1等 ）還原為紫色的結(jié)晶狀的物質(zhì)，沉積在細(xì)胞周圍，然后通過(guò)酶標(biāo)儀讀取OD值，從而檢測(cè)到細(xì)胞增值狀態(tài) 熒光素發(fā)光法細(xì)胞生存能力...
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