瓊脂糖凝膠電泳實驗技巧及異常分析
首先，讓我們了解一下膠液的制備。稱取0.4g瓊脂糖，加入到200ml錐形瓶中，再加入50ml0.5×TBE稀釋緩沖液。隨后，將此瓶放入微波爐加熱，直至瓊脂糖全部融化，取出并搖勻，形成0.8%瓊脂糖凝膠液。值得注意的是，總液體量不宜超過錐形瓶容量的50%，以避免溢出，同時加熱過程中需不時搖動以使瓊脂糖顆粒均勻分布，并在加熱時蓋上封口膜以減少水分蒸發(fā)。
接著，我們進行膠板的制備。在倒膠時，溫度不宜過低，以免凝固不均勻，影響電泳效果。同樣，倒膠速度也要適中，以防止產(chǎn)生氣泡。待膠完全凝固后，使用梳子撥出，注意不要損傷梳底部的凝膠。
然后，進行加樣操作。上樣時要小心謹慎，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿，確保電泳實驗的準確性。
電泳過程需按照特定電壓和電流進行。加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源，并控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍條帶移動至距凝膠前沿約2cm時，應(yīng)停止電泳。
電泳完畢后，移入0.5μg/ml的EB溶液中進行染色，室溫下染色20-25分鐘。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板，DNA的存在處將顯示出肉眼可見的桔紅色熒光條帶。在紫光燈下觀察時應(yīng)戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩，以避免損傷眼睛。
在實驗過程中，還需注意以下幾點細節(jié)：酶切時所加DNA溶液體積不宜過大，以避免DNA溶液中的其他成分干擾酶反應(yīng)；酶活力的使用量需根據(jù)實驗需求適當(dāng)調(diào)整，過量使用酶不經(jīng)濟，且微量雜質(zhì)可能干擾后續(xù)反應(yīng)；市場銷售的酶通常濃度較高，使用前應(yīng)進行適當(dāng)稀釋；酶保存時，應(yīng)控制反應(yīng)液中甘油濃度在10%以下，以防止對酶活性產(chǎn)生影響；觀察DNA時需避免長時間暴露在紫外光下，使用長波長紫外燈(300-360nm)以減少對DNA的切割作用；EB作為強誘變劑，具有中等毒性，配制和使用時需佩戴手套，并妥善處理灑出的EB。
在電泳實驗中，可能會遇到一些異常現(xiàn)象。例如，加樣孔有熒光的情況，可能與DNA滯留、蛋白質(zhì)殘留或特殊樣品雜質(zhì)有關(guān)。較大的DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合后，電泳不能出孔而產(chǎn)生熒光。酶反應(yīng)產(chǎn)物若未進行純化去除酶，也可能在孔中出現(xiàn)熒光。對于植物樣品，可能存在由其他雜質(zhì)殘留引起的熒光。
對于總RNA非變性電泳顯示28S不如18S亮的情況，可能表明28S未被EB飽和，或者基因組DNA的電泳也顯示出類似現(xiàn)象。解決方法可以簡單補染或調(diào)整上樣量和膠中EB的量，確保28S比18S更為明亮。
電泳中出現(xiàn)的降解現(xiàn)象表現(xiàn)為條帶不再突出，向小片段方向彌散，亮度逐漸衰減。如果同時觀察到加樣孔異常亮、彌散發(fā)生在主條帶位置的上下兩個方向、從加樣孔即開始彌散等情況，需要進一步檢測。在徹底勻漿之前，核酸降解的主要原因是樣品保存不當(dāng)或操作不規(guī)范。確保樣品在保存和處理過程中的快速操作，以及選擇合適的裂解液，可以有效減少或避免核酸降解。
為了減少或杜絕核酸降解，關(guān)鍵在于重點放在樣品被徹底勻漿之前。嚴格控制樣品的保存條件，縮短樣品從脫離原來的生存環(huán)境或低溫到被徹底勻漿之間的時間，以確保核酸質(zhì)量。必要時，可以嘗試優(yōu)化裂解過程或選擇更為溫和的處理方法。
質(zhì)粒構(gòu)建完成后,如何確保它能夠正常工作?
確保質(zhì)粒正常工作的關(guān)鍵步驟需逐一進行，以保證實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。首先，通過分光光度法檢測質(zhì)粒DNA的純度，理想A260\/A280比值為1.8-2.0，確保其純度符合標準。其次，利用瓊脂糖凝膠電泳檢查質(zhì)粒DNA完整性，避免DNA降解問題。接著，進行質(zhì)粒結(jié)構(gòu)驗證，包括限制性酶切和測序，確認基因正確插入，...
生物實驗中常用電泳方法
凝膠電泳是利用凝膠物質(zhì)作為支持物進行電泳的方式，瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳是普通電泳中應(yīng)用最多的兩種形式，主要用于分析蛋白質(zhì)和核酸。等電聚焦電泳是一種利用有pH值梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。在穩(wěn)定連續(xù)的線性pH梯度的溶液中進行分離，每一種被分離的兩性物質(zhì)都移向與它...
如何檢測RNA提取成功或如何檢測RNA的完整性?
跟瓊指糖凝膠電泳，有28S和18S的帶，就說明提取成功，如果28S和帶比18S的帶亮2倍，并且后面沒有拖帶，說明沒被降解，完整性好
常見的電泳方法
三、凝膠電泳 由區(qū)帶電泳中派生出的一種用凝膠物質(zhì)作支持物進行電泳的方式。凝膠電泳中的瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳是普通電泳中應(yīng)用最多的兩種形式。目前，這種辦法被廣泛用來分析蛋白質(zhì)和核酸。四、等電聚焦電泳 1．等電聚焦電泳過程 一種利用有pH值梯度的介質(zhì)，分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電...
WB實驗總結(jié)——顯影條帶異常分析&解決思路
在WB實驗中，條帶異常的顯現(xiàn)可能是多種因素導(dǎo)致的。首先，如果你觀察到條帶呈現(xiàn)波浪狀，可能是膠凝固問題或制膠體系不穩(wěn)定，也可能是電流電壓不穩(wěn)定。通過延長凝膠時間并檢查電泳液配制，確認是電流電壓問題后，更換成品電泳緩沖液粉可以解決這個問題。對于目的帶背景過深，可能是蛋白上樣量過多、洗膜不...
qPCR中奇怪的融解曲線分析
非特異性擴增、大片段非特異性擴增、GC含量不均一等。對于這些問題，可通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件、重新設(shè)計引物、使用高分辨率電泳進行確認、或通過增加引物濃度等方式進行解決。若遇到未提到的問題，歡迎在留言區(qū)提問，將提供相應(yīng)的解答。此外，有關(guān)DNA瓊脂糖凝膠電泳常見問題分析的往期內(nèi)容可供參考。
高分文章熱門測序結(jié)果驗證方法,解決你的選擇困擾
在該方法中，總 RNA 或信使 RNA（mRNA）首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補 DNA（cDNA）。再以 cDNA為模板進行 qPCR 反應(yīng)，利用瓊脂糖凝膠電泳，確認RT-PCR 反應(yīng)產(chǎn)物。RT-qPCR 已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中，其中包括基因表達分析、RNA 干擾驗證、微陣列驗證、病原體檢測、基因測試和疾病研究。結(jié)果圖解：...
什么是電泳技術(shù)
電泳是指帶粒子在電場中向與自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。不同的帶電顆粒在同一電場中泳動的速度不同。常用泳動度(或遷移率)來表 示。泳動度是指帶電顆粒在單位電場強度下電泳的速度。電泳技術(shù)以支持物分紙電泳,醋酸纖維素薄膜電泳,淀粉凝膠電泳,瓊脂(糖)凝膠電泳及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。經(jīng)凝膠形狀分有...
被支原體污染的細胞如何檢測?分享4種方法!
PCR 法檢測支原體需要準備支原體PCR 檢測試劑盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、緩沖溶液、瓊脂糖、礦物油等材料與設(shè)備。操作步驟包括樣品收集、模板制作、PCR 反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果分析時，當(dāng)被檢樣品泳道出現(xiàn)明亮條帶，且位置在陽性對照和內(nèi)對照條帶位置之間，即可認為該樣品被支原體污染。掃描電子顯微鏡法...
電泳除銹原理
電泳法,是指帶電荷的供試品(蛋白質(zhì)、核苷酸等)在惰性支持介質(zhì)(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中,于電場的作用下,向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進行泳動,使組分分離成狹窄的區(qū)帶,用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。 電泳技術(shù)的基本原理和分類 在電場中,推動帶電...
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玉州區(qū)可見： ______ 看溴酚藍作為指示,溴酚藍大概跟250bp的條帶位置差不多,如果你的條帶長度短于250bp,那么溴酚藍跑到膠的一半長度就可以拍照了;如果你的條帶長度大于250bp,那么溴酚藍跑到膠的三分之二或者四分之三位置就可以拍照了.主要看你經(jīng)驗,多跑幾次就有感覺了.
玉州區(qū)可見： ______ 水平式瓊脂糖凝膠電泳法,閉合環(huán)狀質(zhì)粒、線性質(zhì)粒和開環(huán)質(zhì)粒DNA由于構(gòu)形不同,在加溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)不同的遷移率,因而在紫外燈下觀察,能區(qū)別閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(cccDNA)、線性質(zhì)粒DNA(L-DNA)和開環(huán)質(zhì)粒DNA(...
玉州區(qū)可見： ______ 不同DNA有自己相應(yīng)的條帶,比如基因組DNA是一條,質(zhì)粒一般是2條.而不同大小的DNA有不同位置,越靠前的電泳速度快說明size小,和ladder比較就可以判斷自己DNA大小.注意這些就可以
玉州區(qū)可見： ______ 看來這時指核小體被酶切后的電泳圖咯,效果有點差哦! 1、4是Marker,2 是染色質(zhì),3是小球菌核酶(micro coccal nuclease)處理的染色質(zhì). 現(xiàn)象描述:在約200-1000bp有明顯的梯度帶(每帶隔約200bp), 這時因為用一種能使DNA降解的...
玉州區(qū)可見： ______ 應(yīng)用: 1、DNA的制備. ⑴ 適合分離大片段DNA. 瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段,其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低,但它制備容易,分離范圍廣,尤其適于分離大片段DNA.普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb,利用脈沖...
