影響免疫檢測的因素有哪些
影響免疫檢測的因素有哪些
影響免疫檢測的因素有很多，包括緩沖液、封閉、抗體、清洗、檢測底物等等。下面是我為大家?guī)淼挠绊懨庖邫z測的因素的知識，歡迎閱讀。
緩沖液
最常用的兩種緩沖液是磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris緩沖液(TBS)。調整配方中緩沖液組分的各種改良配方已見諸期刊。緩沖液的關鍵要求是它應有助于保持抗體的生物活性。因此，離子強度和pH值應相當接近生理狀態(tài)。PBS的配方(磷酸鹽總濃度10mM)適用于廣泛的抗體和檢測底物。
在孵育過程中，裝有膜的容器應輕輕搖動。緩沖液的量應足夠，完全覆蓋膜，使其在緩沖液中自由漂浮。如果不止一張印跡放在容器中，緩沖液容量不足會導致印跡膜粘在一起。這將影響孵育溶液的充分接觸，導致各種假象，如背景高、信號弱和靈敏度不均勻等。
封閉
要獲得有意義的結果，必須保證抗體只與感興趣的蛋白質結合，而不與膜結合。利用惰性蛋白、非離子去污劑，或無蛋白的封閉劑來封閉膜上未被占據的位點，可減少抗體的非特異結合(NSB)。
封閉劑與膜的親和力應高于抗體。它應填滿膜上未被占據的位點，但不會替換膜上的目標蛋白。最常用的封閉劑是牛血清白蛋白(BSA，0.2-5.0%)、脫脂牛奶、酪蛋白、明膠、吐溫20去污劑的稀釋液(0.05-0.1%)以及Bløk®試劑。封閉劑通常溶解在PBS或TBS中。
與封閉相關的風險包括：選擇不適當的封閉劑或過量封閉會替換或掩蓋目標蛋白質。因此，封閉劑的正確選擇對成功的免疫檢測很關鍵。例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白標記的抗體，因為牛奶中含有糖蛋白和生物素。在用磷酸化特異性抗體對磷酸化蛋白進行檢測分析時，如果采用粗蛋白制劑作為封閉劑，由于這些制劑中可能含有磷酸酶，而印跡上的磷酸化蛋白會被這些酶去磷酸化，就有可能會影響分析結果。研究表明，在封閉液中添加磷酸酶抑制劑可增強磷酸化特異性抗體的信號。此外，適用于一種抗原-抗體組合的封閉劑可能不適用于其他組合。
封閉液被點樣在空白的PVDF膜上，而膜已在甲醇中浸潤，并在TBS中平衡。隨后在印跡上添加檢測試劑，孵育5分鐘，并曝光在X射線膠片上。暗斑的出現則表明封閉劑與檢測試劑不兼容。如果在標準的Western印跡操作中用Immobilon®-P轉印膜來替代Immobilon®-PSQ轉印膜，那么封閉液可能不足以飽和膜表面。可能需要更多的清洗步驟來降低背景。
抗體
在封閉之后，印跡與一個或多個抗體孵育。第一個抗體與目標蛋白結合，而第二個抗體與第一個結合。第二個抗體結合有酶或染料，可用來指示蛋白的位置。
盡管一抗能直接標記，但使用二抗有明顯的優(yōu)勢。首先，不止一個二抗分子能夠與單個一抗分子結合，形成信號擴增。其次，標記的二抗(酶-抗體結合物)可用于大量不同特異性的一抗，從而不再需要標記多個一抗。
多克隆或單克隆的`一抗都可使用。多克隆抗體通常是以抗血清或親和純化的抗體形式提供的。單克隆抗體是在腹水或組織培養(yǎng)液中表達的，可直接使用或進行親和純化。一定要記住，變性蛋白可能無法被天然抗原培育出的抗體所識別。在某些情況下，可能需要非變性凝膠來進行印跡。抗體以緩沖液和封閉液稀釋，以避免與膜的非特異結合。抗體稀釋液通常也包含痕量的吐溫20或另一種去污劑，以防止抗體的非特異聚集。許多發(fā)表的化學發(fā)光操作需要在封閉液和抗體稀釋液中添加0.1%(v/v)吐溫20。我們必須認識到，高于0.05%(v/v)的濃度有可能從膜上洗掉一些印跡的蛋白質。
提高吐溫20去污劑的濃度通常會降低背景。一種更簡單且更經濟的策略是降低抗體的濃度，特別是二抗(詳見圖1)。抗體必須特異針對目的蛋白，不能與封閉液中的組分交叉反應，且應該是相對純凈的。其他蛋白質或聚集物形式的雜質會導致非特異性結合和背景增高。
免疫檢測是一種極其靈敏的方法。為了實現高的信噪比和最高的靈敏度，一抗和二抗的濃度應針對每種情況來優(yōu)化。一般來說，高倍稀釋一抗或降低凝膠上的蛋白上樣量可減少非特異信號。高倍稀釋酶標記的二抗可最大限度降低整體的高背景。
一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測試劑的靈敏度。高靈敏度的試劑(檢測到飛克級)與低靈敏度的試劑(檢測到皮克級)相比，抗體用量可減少20倍。抗體濃度的優(yōu)化取決于檢測底物的例子如圖13所示。在使用最靈敏的檢測試劑時，過量的抗體導致高的非特異性和整體背景增高(左上)。在這種情況下，將一抗稀釋度從1:1,000提高到1:10,000，改善了信噪比。在使用沒那么靈敏的檢測試劑(中間和最下面一行)時，抗體需要更為濃縮，以產生相同的信號。
清洗
清洗印跡，從膜上去除未結合的抗體，它們可能導致高背景和檢測不佳。通常使用吐溫20的PBS或TBS稀釋液(0.05% v/v)，特別是當抗體制劑是粗制的，或高濃度使用時。如前所述，濃縮的去污劑溶液可能導致感興趣的蛋白質從膜上洗脫。對于高度純化的抗體，往往只使用緩沖液進行清洗。
所需的清洗次數最好根據實驗來確定。清洗太少會產生過多的背景，而清洗過度有可能洗脫抗體并降低信號。建議至少清洗三次，每次5分鐘。
在TBS清洗液中添加最多0.5M NaCl和0.2% SDS，并將清洗時間延長至2小時，可降低頑固的背景。
;影響免疫比濁測定的因素不包括
正確答案:D 解析：免疫比濁測定的影響因素包括：抗原抗體的比例、抗體的質量、抗原抗體反應的緩沖液、增濁劑 。
哪些外界因素會影響免疫功能
維生素B12、B6、鐵、的缺乏對中性粒細胞和巨噬細胞的功能有抑制作用。飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸過多，均能抑制細胞免疫反應，抑制中性粒細胞趨化性和吞噬功能。因此肥胖的人往往比瘦的人易感染。高膽固醇血癥患者T細胞、B細胞和網狀內皮系統(tǒng)功能均底下。 3、睡眠因素 睡眠除了可以消除疲勞，使人產生新的...
科普:hiv抗體檢驗的影響因素
目前廣泛使用的方法包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、免疫印跡（Western blot）、免疫熒光（IFA）、化學發(fā)光免疫吸附法（CLIA）、酶免疫印跡法（EIA）和流式細胞術（FCM）。這些方法操作簡便、檢測靈敏度高、特異性強，是常用的HIV感染診斷方法。HIV抗體檢驗的影響因素有四個主要方面：(一) 感染時間 最佳...
影響抗原免疫應答的因素
影響抗原抗體反應的因素有哪些呢？跟著小編來學習一下吧！一、 反應物自身因素 1. 抗體：濃度、特異性、親和性和等價帶的寬窄都影響抗原抗體反應。應選擇高特異性、高親合力的抗體作為診斷試劑。但單克隆抗體不適用于沉淀反應。2. 抗原：理化性狀、分子量、抗原表位的種類及數目均可影響反應結果。顆粒性...
影響免疫組織化學技術的因素有哪些
免疫組化技術對于研究 腫瘤的發(fā)展規(guī)律，進行良惡性分類及鑒別診斷具有重要的作用。免疫組化染色的結果，與組織的固定、抗原的修復、抗體的保存及使用三個重要因素相關密切。1、 固定 常用的組織固定液是甲醛，標本必須及時固定，這有利于抗原的保存，防止抗原在組織細胞內彌散、丟失或失去免疫活性，但固定...
影響免疫濁度測定的因素,不包括
正確答案:E 解析：增強劑可促進免疫復合物的形成，但不是影響免疫濁度測定的因素 。其他選項為影響抗原-抗體結合與否及復合物形成的量的多少的因素，影響免疫濁度測定 。
影響對流免疫電泳的因素是什么?
影響結果的因素 （1）抗原抗體的比例：抗原抗體比例適應時容易出現沉淀帶，反之不易發(fā)生。當抗體濃度恒定時，被檢血清含甲胎蛋白濃度高時，作10倍、20倍或更高倍數稀釋可以提高陽性率。隨稀釋度的增加，抗原抗體的比例發(fā)生變化，沉淀線由靠近抗血清孔向逐步移向兩孔中間，并可出現不典型的沉淀線如弧形...
免疫因素是什么意思?
免疫因素能夠影響人體免疫功能的強弱，從而影響健康狀況。免疫功能低下容易導致感染病、自身免疫性疾病等疾病的發(fā)生。同時，免疫功能的正常和穩(wěn)定能有效對抗外部侵襲，維持身體的正常狀態(tài)，從而保證身體健康。人們可以通過科學生活方式來提高免疫因素，比如更有規(guī)律地作息，充足的睡眠，均衡的飲食，適量的運動。
免疫斑點試驗的影響因素
濃度過高可出現假陽性，過低則降低試驗的敏感性。 2. 酶結合物濃度對試驗成功與否至關重要。最適濃度常與包被抗原濃度有關，應根據試驗具體條件作方陣滴定來確定。 3. 顯色時間，一般認為5-10分鐘較好。顯色時間過長常導致本底著色加深，降低試驗的特異性。 4. 用抗原包被NC檢測抗體時，待檢樣品加...
生殖免疫全套檢查哪些項目
5、抗透明帶抗體，主要干擾精卵的正常結合，干擾受精卵著床，引起女性不孕反應；6、抗HCG抗體，有流產史的女性比較多見，抑制HCG對胎兒的保護，降低體內的激素水平，引起女性不孕；7、抗卵泡刺激素抗體，影響正常卵泡的發(fā)育，抑制卵泡刺激素的作用，引起不孕。除外這些因素還有相關的免疫檢測，如封閉性抗體...
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納雍縣運動： ______ 病情分析:你好,對于你的情況,只要有丙肝,不管有什么其它影響都會檢測出來 意見建議:
