從零開始，手把手教你WB實驗全過程
實驗原理：WB使用抗體作為探針，將電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上，并與靶蛋白的抗原表位發(fā)生免疫反應(yīng)，實現(xiàn)對細(xì)胞或組織提取的蛋白混合物中特定蛋白的鑒別和半定量分析。目的是鑒別特異性蛋白的類型（如亞型、聚體、剪切體等）和蛋白表達(dá)量的變化。
實驗步驟：實驗主要分為樣品準(zhǔn)備、蛋白質(zhì)提取、蛋白質(zhì)濃度測定、SDS-PAGE凝膠制備、上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、洗滌、顯影曝光和結(jié)果展示等步驟。
樣品準(zhǔn)備：明確所檢測目的蛋白的表達(dá)情況，正確選擇和處理樣本。
蛋白質(zhì)提取：需在冰上操作，加入磷酸酶抑制劑，以減少高溫引起的蛋白降解。
蛋白質(zhì)濃度測定：使用BCA法測定蛋白質(zhì)含量，原理基于蛋白質(zhì)與Cu+生成的絡(luò)合物在562nm處有高的光吸收值，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。
SDS-PAGE凝膠制備：根據(jù)目標(biāo)蛋白大小、表達(dá)位置和樣本數(shù)量選擇分離膠和濃縮膠濃度、凝膠厚度和數(shù)量。
上樣電泳：確保一個泳道的蛋白總量為30μg，并保持每個泳道上樣體積一致，使用濃縮膠和分離膠進(jìn)行電泳。
轉(zhuǎn)膜：選擇濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法，確保膜與膠完全貼合，避免氣泡。
封閉：將PVDF膜放入TBST中洗滌，再轉(zhuǎn)入封閉液中室溫封閉1h。
一抗孵育：根據(jù)抗體說明書稀釋一抗，將膜放入抗體孵育盒中過夜孵育。
二抗孵育：選擇合適的二抗，根據(jù)一抗來源稀釋二抗，將膜在TBST中洗滌后，放入抗體孵育盒中室溫孵育1h。
洗滌：TBST洗膜3次，每次5min。
顯影曝光：使用ECL發(fā)光液，將PVDF膜放入暗盒中孵育5min，然后置于儀器中曝光拍照。
結(jié)果展示：參照相關(guān)文獻(xiàn)，展示W(wǎng)B實驗結(jié)果。
通過以上步驟，你將能從零開始，掌握WB實驗的全過程，產(chǎn)出美觀、結(jié)果準(zhǔn)確的實驗圖。
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