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引物 熒光定量PCR 是利用熒光定量PCR 儀（如ABI 7500、stepone、ROChe LightCycler、Bio-Rad CFX96 等）通過實時追蹤 PCR 每一步循環(huán)的熒光信號 值來達(dá)到對起始模板量的定量分析。一次成功的熒光定量 PCR 反應(yīng)除了需要穩(wěn) 定的儀器、優(yōu)質(zhì)的 Taq 酶、比較好的模板質(zhì)量，更需要高質(zhì)量的引物對。想要 得要高質(zhì)量的引物對的前提是引物的設(shè)計必須要精益求精。下面我們以人IL6 因為例（以人IL6基因mRNA 序列作為模板設(shè)計引物），給大家講解如何進(jìn)行高 質(zhì)量的引物設(shè)計。 （1）利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫，查詢基因的序列。登錄 NCBI 官方主頁： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。在欄目項中選擇“Gene”，關(guān)鍵詞輸入“IL6 homo”，具體如下所示，點(diǎn)擊“Search”。（2）結(jié)果如下，一般第一條基因即為所要查詢的基因，這里需要注意“Aliases” 一欄，因為很多基因有很多別名，在查詢時需要注意。明確基因后，直接點(diǎn)擊 ，進(jìn)入人IL6 基因的主頁。 上海捷瑞生物工程有限公司（3）進(jìn)入人 IL6 基因的主頁后，往下拉動網(wǎng)頁，看到如下界面。由于我們設(shè)計 引物的模板是mRNA，所以我們要找到該基因的轉(zhuǎn)錄本信息。點(diǎn)擊“reference sequence details”。 （4）得到如下界面，我們看到，人IL6 基因在NCBI 里的記錄是2 個轉(zhuǎn)錄本， 我們在設(shè)計引物時，除非需要檢測某個特定的轉(zhuǎn)錄本，一般的做法是將該基因所 有的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行比對分析，找到他們共有的序列區(qū)域，選擇該共有區(qū)域作為 模板設(shè)計引物，這樣設(shè)計的引物就能盡可能的擴(kuò)增出該基因的所有mRNA 信息。 針對IL6 基因，我們分別點(diǎn)擊“NM_000600.4”和“NM_001318095.1”打 開這兩個轉(zhuǎn)錄本信息。 上海捷瑞生物工程有限公司（5）我們看到，人IL6 基因的兩個轉(zhuǎn)錄本序列大小不一樣，分別為1197bp 1006bp。我們將這兩條mRNA序列復(fù)制到比對軟件（如BIOEDIT 用軟件對這兩條序列進(jìn)行比對分析。（6）比對結(jié)果如下，從比對結(jié)果看出，這兩條序列前后均一致，只有轉(zhuǎn)錄本2 在141-331bp 處發(fā)生了缺失，我們選擇共有區(qū)域331bp-1197bp 的序列作為 上海捷瑞生物工程有限公司模板設(shè)計引物。 （7）將這段共有序列復(fù)制到引物設(shè)計軟件中，引物設(shè)計的軟件很多，比如 Primer premier6.0、Oligo7.37、在線Primer3、Beacon Designer、在線NCBI Primer-BLAST 等。不同的引物設(shè)計軟件的工作原理大同小異，基本都具備引物 設(shè)計的基本原則（后面列出），但是對引物Tm值的計算結(jié)果不同的軟件可能有 差異，這主要跟計算方法有關(guān)。捷瑞生物提供免費(fèi)的引物設(shè)計服務(wù)，所使用的設(shè) 計軟件是自主開發(fā)，并自主運(yùn)行ePCR（電子PCR），具備引物BLAST 功能，盡 量選擇最優(yōu)化的引物對。下面以在線NCBI Primer-BLAST 為例，說明引物的設(shè) 計過程。 （8）打開在線NCBI Primer-BLAST 。將序列復(fù)制到制定的位置，如下圖。在“PCR product size”選擇 Min“80”；Max“250”（熒光定量PCR 產(chǎn)物的大小盡量不要很大，保證PCR 擴(kuò)增的效率）。在“Database”一欄選擇mRNA 數(shù)據(jù)庫（一般默認(rèn)為Refseq mRNA）。在“Organism”一欄選擇物種是人（一般默認(rèn)為Homo sapiens）。 一切設(shè)置好后，點(diǎn)擊“Get Primers”即可。 上海捷瑞生物工程有限公司（9）打開后會出現(xiàn)以下選擇項，需要觀察這段序列是否屬于所要設(shè)計的基因序 列，這里直接點(diǎn)擊“Submit”即可。 （10）得到如下結(jié)果，圖中給出所設(shè)計的引物的上下游引物位置；具體的某一 對引物的參數(shù)；該對引物的ePCR 結(jié)果等。考察一對引物質(zhì)量是否理論上優(yōu)異， 需要看如下幾個方面：引物Tm值一致，盡量在60左右；引物盡量無發(fā)卡結(jié) 構(gòu)二聚體等；ePCR 產(chǎn)物盡量單一，盡量無非特異性產(chǎn)物等。 上海捷瑞生物工程有限公司（11）至此，引物設(shè)計的工作就結(jié)束了，接下來就是將設(shè)計的引物序列發(fā)送到 引物合成公司合成，在拿到引物成品后，按照儀器和相關(guān)試劑盒說明書做預(yù)實驗， 調(diào)試引物的質(zhì)量。理論上，選擇再優(yōu)的引物對，只有且只能通過真實的實驗驗證， 才能100%確定該對引物是否能用。在做熒光定量P CR 實驗時，對引物擴(kuò)增效 率的測試非常的重要，這塊后續(xù)我們再具體探討。 （12）熒光定量PCR 引物設(shè)計的一般原則： PCR產(chǎn)物的長度在70-300bp 之間，避免產(chǎn)物太長導(dǎo)致PCR 擴(kuò)增效率降低， 影響定量結(jié)果； 引物設(shè)計的區(qū)域盡量選擇在mRNA的3’段，盡量保證擴(kuò)增的產(chǎn)物為該基因 所表達(dá)的全部mRNA 信息； 如果一個基因有很多轉(zhuǎn)錄本，盡量選擇他們的共有序列為模板來設(shè)計引物，保證擴(kuò)增產(chǎn)物的穩(wěn)定性； 引物盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體結(jié)構(gòu)、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物Tm值不一致、引物序列中有連續(xù)4 個堿基以上的Poly 結(jié)構(gòu)等等； 總之，理論上再好的引物對，只有通過真實的實驗驗證才能判斷其是否能用、好用。

如何設(shè)計sybrgreen法熒光定量pcr引物
Rotro-Gene 用幾種析絕定量數(shù)據(jù)包括標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)R值反應(yīng)效率都呈現(xiàn)外析調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線并讓與標(biāo)準(zhǔn)品相調(diào)整（或重復(fù)相同標(biāo)準(zhǔn)品）功能確定斜率重復(fù)性與Y截距基礎(chǔ)完標(biāo)準(zhǔn)曲線說單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)足夠我同通道甚至通道內(nèi)繪制條標(biāo)準(zhǔn)曲線提功能主要些想用SYBR-Green析兩基使用者 ii)相定量 相定量指兩或更基互相進(jìn)行比較...

如何設(shè)計熒光定量PCR的引物及TaqMan探針
最后提到的功能主要是為了那些想用SYBR-Green分析兩個基因的使用者。ii)相對定量 相對定量是指兩個或更多的基因互相進(jìn)行比較，其結(jié)果是一個比率。沒有確切的數(shù)字被檢測道。一種檢測基因表達(dá)相對定量的方法叫“比較CT值法（⊿⊿Ct）這種方法可以徹底不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過觀察與一個動態(tài)相關(guān)對照比較的表達(dá)水...

如何作QPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線
作QPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用PCR－ELISA法作。具體如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合；再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。通過測定...

如何用qpcr計算轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)
2、熒光定量PCR 利用新型、靈敏、高通量實熒光定量PCR用于測定原始品系轉(zhuǎn)基絕拷貝數(shù)實熒光定量PCR技術(shù)種較新DNA定量其定量基本原理PCR反應(yīng)體系加入非特異性熒光染料（：SYBR GREEN I）或特異性熒光探針（：Taqman 探針）實檢測熒光量變化獲同品達(dá)定熒光信號（閾值）所需循環(huán)數(shù)：CT值（Cycle Threshold）；通...

如何作QPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線
SYBR@Green等染料法,最好在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后,加一個溶解程序,來形成溶解曲線,判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增。而溶解程序,儀器都有默認(rèn)設(shè)置,或稍有不同,但都是一個在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時候,進(jìn)行熒光信號的收集。3.儀器設(shè)置所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時候包括反應(yīng)板設(shè)置(platesetup)和程序設(shè)置(programsetup)。我們以ABI...

如何通過qpcr看一個基因的表達(dá)豐度
SYBR@Green等染料法,最好在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后,加一個溶解程序,來形成溶解曲線,判斷PCR產(chǎn)物的特 異性擴(kuò)增。而溶解程序,儀器都有默認(rèn)設(shè)置,或稍有不同,但都是一個在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時候,進(jìn)行熒光信號的收集。 3. 儀器設(shè)置所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時候包括反應(yīng)板設(shè)置(plate setup)和程序設(shè)置(program setup)。

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