如何通過(guò)qpcr看一個(gè)基因的表達(dá)豐度 生物學(xué)教育屬于理工類(lèi)專(zhuān)業(yè)嗎?
一般來(lái)講，進(jìn)行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個(gè)樣品至少要做3個(gè)平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通常來(lái)講，反應(yīng)體系的引 物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因 的表達(dá)豐度進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng)驗(yàn)值，在操作過(guò)程中，還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個(gè)最佳反應(yīng)體系。在反應(yīng)體 系配置過(guò)程中，有下面幾點(diǎn)需要注意：
1. MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix進(jìn)行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個(gè)槍頭加樣！
4. 所有成分加完后，離心去除氣泡。
5. 每個(gè)樣品至少3個(gè)平行孔。
參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊(cè)商標(biāo)了！）或者其他染料，只要不影響檢測(cè)PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量 反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線。現(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常來(lái)講，real-time qPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長(zhǎng)度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，加一個(gè)溶解程序，來(lái)形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特 異性擴(kuò)增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個(gè)在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時(shí)候，進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。
3. 儀器設(shè)置
所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時(shí)候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：
A. 首先是實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進(jìn)行“定量”實(shí)驗(yàn)。
B. 實(shí)驗(yàn)方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進(jìn)行。
C. 目的基因的設(shè)置：有幾個(gè)目的基因和目的基因的名稱(chēng)。
D. 樣品的設(shè)置：包括哪個(gè)是實(shí)驗(yàn)組，哪個(gè)是對(duì)照組。以及負(fù)對(duì)照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。
E. 對(duì)照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個(gè)是為后面的定量做準(zhǔn)備
F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是95℃15秒，60℃15秒的40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以。或者是儀器說(shuō)明書(shū)上建議的程序。
G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：
A-G這五個(gè)步驟簡(jiǎn)單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。
需要注意一點(diǎn)ABI儀器需要加ROX參比染料，默認(rèn)的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨(dú)分開(kāi)。要根據(jù)不 同公司的MasterMix進(jìn)行這一個(gè)步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒(méi)有參比染料，所以選擇“none”。
設(shè)置好之后，就可以把配置好的PCR管放進(jìn)儀器，點(diǎn)擊RUN！
五、Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析
1. Real-time qPCR常見(jiàn)參數(shù)
基線（baseline）
通常是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)
同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線
閾值（threshold）
自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍
手動(dòng)設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。
同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。
Ct值:與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。
分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）。
2.影響Ct值的關(guān)鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個(gè)合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間。
反應(yīng)液成分的影響
任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應(yīng)的效率
PCR反應(yīng)的效率也會(huì)影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會(huì)所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說(shuō)來(lái)，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。
3. 如何評(píng)估實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的效果
PCR擴(kuò)增效率：為了正確地評(píng)估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。
常見(jiàn)問(wèn)題
1. 無(wú)Ct值出現(xiàn)
檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。
引物或探針降解: 可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性。
模板量不足: 對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
模板降解: 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
2. Ct值出現(xiàn)過(guò)晚（Ct>38）
擴(kuò)增效率低: 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。
PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。
PCR產(chǎn)物太長(zhǎng): 一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳
加樣存在誤差: 使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。
標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解: 應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
引物或探針不佳: 重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針。
模板中存在抑制物，或模板濃度過(guò)高
4. 負(fù)對(duì)照有信號(hào)
引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
模板有基因組的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。
5. 溶解曲線不止一個(gè)主峰
引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。
模板有基因組的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。
6. 擴(kuò)增效率低
反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。
反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋?zhuān)偌尤敕磻?yīng)體系中，減少抑制物的影響。
7. 同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？
判斷標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增效率，靈敏度，特異性
如果擴(kuò)增效率在90%-110%，都是特異性擴(kuò)增，都可以把數(shù)據(jù)用于分析。
8. 擴(kuò)增曲線的異常？比如“S”型曲線？
參比染料設(shè)定不正確(MasterMix不加參比染料時(shí)，選NONE)
模板的濃度太高或者降解
熒光染料的降解
熒光定量PCR問(wèn)題匯總
1. 定量PCR儀的開(kāi)關(guān)機(jī)順序是怎樣的？
按照正確的開(kāi)關(guān)機(jī)順序操作，有助于延長(zhǎng)儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。
開(kāi)機(jī)順序：先開(kāi)電腦，待電腦完全啟動(dòng)后再開(kāi)啟定量PCR儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開(kāi)定量PCR的收集軟件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
關(guān)機(jī)順序：確認(rèn)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號(hào)收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機(jī)的電源，最后關(guān)閉電腦。
2. 哪些種類(lèi)的反應(yīng)管和蓋子適合定量PCR實(shí)驗(yàn)使用？有何需要注意的地方？
定量PCR實(shí)驗(yàn)可以使用以下耗材：96孔光學(xué)反應(yīng)板配合光學(xué)膜，0.2 ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合光學(xué)膜，0.2 ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合平蓋的光學(xué)八聯(lián)管蓋。ABI公司生產(chǎn)的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號(hào)見(jiàn)下表：
3. 為什么要定期對(duì)電腦進(jìn)行磁盤(pán)碎片整理？怎樣整理？
當(dāng)運(yùn)行實(shí)時(shí)定量PCR儀及使用軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)算機(jī)會(huì)刪除并創(chuàng)建若干文件，計(jì)算機(jī)硬盤(pán)的空閑空間會(huì)被分割成越來(lái)越多的小塊。當(dāng)硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器上文件以 分解的碎片存儲(chǔ)時(shí)，程序需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能存取文件，因?yàn)楸仨毝啻螌ふ椅募槠源嫒〔煌钠瑪唷Ｋ槠韺?shí)用程序?qū)⒁粋€(gè)文件分解開(kāi)的多個(gè)碎片合并在一 起，并存儲(chǔ)到硬盤(pán)的同一個(gè)位置，從而清除文件碎片，進(jìn)而優(yōu)化系統(tǒng)性能。
碎片整理的方法如下：
· 在Windows桌面上，選擇開(kāi)始(start)，我的電腦(My computer)。
· 在(我的電腦)窗口中，用鼠標(biāo)右鍵單擊硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器，并選擇(屬性)property。
· 在(屬性)對(duì)話框中選擇工具(Tools)選項(xiàng)卡，單擊開(kāi)始整理(Defragment now)。
· 單擊碎片整理(Defragment)。
· 當(dāng)顯示“碎片整理完畢”對(duì)話框時(shí)，單擊（確定）。
· 在“本地磁盤(pán)屬性”對(duì)話框中，單擊（確定）。
· 為計(jì)算機(jī)機(jī)中剩余的驅(qū)動(dòng)器重復(fù)如上步驟。
4. 何時(shí)執(zhí)行windows service pack更新？
不要執(zhí)行該操作。除非美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司代表通知您更新操作系統(tǒng)，否則請(qǐng)不要更新控制定量PCR 儀的計(jì)算機(jī)的操作系統(tǒng)。新版本的Microsoft Windows操作系統(tǒng)有可能與SDS 軟件存在沖突，并導(dǎo)致儀器不能正常運(yùn)行。如果您希望安裝service pack（更新包）以更新操作系統(tǒng)，應(yīng)查看隨SDS 軟件提供的版本說(shuō)明，避免兼容性問(wèn)題。
5. 應(yīng)該備份哪些數(shù)據(jù)？
應(yīng)該定期備份您的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，備份頻率推薦每周一次，用光盤(pán)刻錄。同時(shí)您也應(yīng)該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這些文件所在的目錄是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下圖是校正文件的樣本。
6.怎么樣的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境才能保證儀器設(shè)備正常運(yùn)行？
良好的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境有助于延長(zhǎng)儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個(gè)方面：
電源：推薦配備合適的UPS或穩(wěn)壓器。
通風(fēng)：儀器的通風(fēng)應(yīng)該沒(méi)有阻擋。
溫度：推薦實(shí)驗(yàn)室配備空調(diào)，溫度應(yīng)該控制在10-30°C之間。
濕度：20-80%；對(duì)于潮濕的省份，推薦實(shí)驗(yàn)室配備除濕機(jī)。
空間：易于操作，安全。
7. 怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？
一個(gè)辦法是運(yùn)行背景校正反應(yīng)板，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號(hào)，則表明該孔可能被熒光污染物。
另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行ROI的校正，當(dāng)某個(gè)孔的信號(hào)明顯高出其他孔時(shí)，則表明該孔被污染。
清除樣本加熱塊污染的步驟如下：
用移液器吸取少量乙醇并滴入每個(gè)污染的反應(yīng)孔中。
吹打數(shù)次。
將廢液吸入廢液杯中。
重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。
確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完。
8. 什么是背景校正？多長(zhǎng)時(shí)間執(zhí)行一次背景校正？
背景校正程序測(cè)量定量PCR儀所使用的反應(yīng)管和水的空白熒光強(qiáng)度。在運(yùn)行校正程序期間，定量PCR儀在10分鐘內(nèi)連續(xù)讀取背景校正板的熒光強(qiáng)度，信號(hào)收 集的溫度為60°C。隨后，SDS軟件計(jì)算所收集到的熒光強(qiáng)度的平均值，提取結(jié)果并保存到校正文件中。軟件在今后的分析中將自動(dòng)調(diào)用此校正文件，從實(shí)驗(yàn)數(shù) 據(jù)中扣除背景信號(hào)。
因?yàn)楸尘盁晒獾男盘?hào)強(qiáng)度隨著許多外界因素（比如外來(lái)的污染、反應(yīng)板/反應(yīng)管的生產(chǎn)廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進(jìn)行背景校正，一般每三個(gè)月到半年校正一次。
9. 什么是純熒光校正？多長(zhǎng)時(shí)間校正一次？
純熒光校正是測(cè)定各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的波長(zhǎng)和信號(hào)強(qiáng)度，通俗地說(shuō)是讓儀器“認(rèn)識(shí)”各種熒光染料。軟件收集并儲(chǔ)存各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信息。以后 每次定量實(shí)驗(yàn)運(yùn)行過(guò)程中，SDS軟件收集樣品的原始光譜信號(hào)，并將此原始光譜與純熒光文件中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，精確扣除不同染料的信號(hào)重疊部分，從而確定樣 品中的熒光染料種類(lèi)和信號(hào)強(qiáng)度。
推薦每半年進(jìn)行一次純熒光校正。在運(yùn)行光譜校正之前，請(qǐng)先進(jìn)行背景校正和ROI校正。
10.96孔板怎樣封膜？
當(dāng)使用96孔板做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，推薦使用光學(xué)膜代替蓋子來(lái)密封反應(yīng)孔。正確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然后橫向，最后沿著板的邊緣按壓使之密封。
11.使用單管或8連管做實(shí)驗(yàn)時(shí)，在樣品加熱塊上應(yīng)該怎樣安排放置？
使用單管或8連管做實(shí)驗(yàn)，并且樣本數(shù)量不多的時(shí)候，建議在樣品加熱塊(TRAY)上對(duì)稱(chēng)地安放樣品，最好是縱向放置，并且優(yōu)先放在第6列或第7列，然后 逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來(lái)的時(shí)候不至于發(fā)生傾斜，各個(gè)反應(yīng)管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的數(shù)據(jù)精密性.
12. 絕對(duì)定量與相對(duì)定量有什么區(qū)別？
絕對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說(shuō)的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。
舉例來(lái)說(shuō)，如果研究項(xiàng)目中包括處理過(guò)的和未經(jīng)處理的對(duì)照樣本，通常可以將未經(jīng)處理的樣本指定為基準(zhǔn)，規(guī)定其目的基因濃度為100%，將經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果除以對(duì)照樣品的定量結(jié)果，就可以計(jì)算各個(gè)處理樣本的基因含量相對(duì)于未處理樣品的百分比。
絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為 簡(jiǎn)便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個(gè)已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。
CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對(duì)數(shù)成反比的數(shù)學(xué)關(guān)系，來(lái)計(jì)算不同樣本之間的相對(duì)百分比，其計(jì)算公式是。
絕對(duì)定量的數(shù)據(jù)易于理解，但是絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的制備和測(cè)定其DNA含量比較困難。有許多商業(yè)性的標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒供選購(gòu)，可以解決這種困難。
相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品容易在實(shí)驗(yàn)室里自己制備，但是數(shù)據(jù)處理比較麻煩，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的解釋有一定難度。
13. 定量PCR基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？
總的來(lái)說(shuō)，有三個(gè)層次的校正是必須要做的。
首先，參比信號(hào)校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由于反應(yīng)總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的 熒光信號(hào)波動(dòng)都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映PCR進(jìn)程。ROX校正能夠極大地改進(jìn)定量的精確度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。
其次，內(nèi)對(duì)照校正。實(shí)驗(yàn)中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來(lái)自不同數(shù)目的細(xì)胞，所以將實(shí)驗(yàn)結(jié)果校正到每個(gè)細(xì)胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同時(shí)定量一個(gè)內(nèi)對(duì)照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S。內(nèi)對(duì)照校正使不同樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以相互比較。
第三，計(jì)算相對(duì)于基準(zhǔn)樣品(Calibrator)的相對(duì)基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時(shí)和6小時(shí)的、正常和患病的之間的基因表達(dá)的差別，則需要計(jì)算處理/未處理、6小時(shí)/0小時(shí)、患病/正常。
14. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對(duì)定量的數(shù)據(jù)應(yīng)該怎么處理？
假設(shè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時(shí)IL-2基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用的內(nèi)對(duì)照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測(cè)定結(jié)果都是總RNA的pg數(shù)，數(shù)據(jù)的處理方法見(jiàn)下表：
15.什么是CT值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？
CT值與起始DNA濃度的對(duì)數(shù)成反比：
如果(1)不同管之間的PCR反應(yīng)效率相同；(2)這些PCR的反應(yīng)效率接近100%，可以從上面的公式推出相對(duì)含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假設(shè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時(shí)IL-2基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用內(nèi)對(duì)照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測(cè)定結(jié)果都是CT值，而沒(méi)有通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總RNA的pg數(shù)。
16. 每個(gè)反應(yīng)管中可以加入多少種探針？
每個(gè)反應(yīng)管中可以加入的探針數(shù)目，取決于儀器、軟件、試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等幾個(gè)方面。
首先是儀器的硬件構(gòu)成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下，全波長(zhǎng)檢測(cè)的定量PCR儀如激光管-CCD類(lèi)型對(duì)于探針的數(shù)量實(shí)際上是沒(méi)有限制 的。如果信號(hào)的采集要通過(guò)濾色片，那么探針的數(shù)量取決于濾色片的數(shù)目，增加探針需要增加或改變?yōu)V色片。改動(dòng)儀器的結(jié)構(gòu)通常很困難。以AB公司的儀器為 例，7900和7700是激光-全波長(zhǎng)檢測(cè)的，7000、7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。
其次是化學(xué)上的可能性。不同的熒光基團(tuán)要組合到一起，在同一反應(yīng)管內(nèi)使用，必須其激發(fā)波長(zhǎng)既相對(duì)靠近又不能靠得太近，既保證信號(hào)激發(fā)的效率又保證信號(hào)不 重疊干擾，能夠區(qū)分清楚。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的熒光基團(tuán)種類(lèi)有限，滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達(dá)到每組4到5種熒光的水平。
第三是實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和選用的探針類(lèi)型。定量PCR實(shí)驗(yàn)必須使用ROX校正熒光，占去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(tuán)(TAMRA)也要占用一種 熒光，對(duì)于4色檢測(cè)的儀器來(lái)說(shuō)，只剩下2種熒光可以標(biāo)記探針，對(duì)于5色檢測(cè)的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針，由于它的淬滅基團(tuán)是不發(fā)熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標(biāo)記探針。如果實(shí)驗(yàn)要求不高，不做ROX校正（AB公司不推薦這樣 做），還可以再多一種熒光用于標(biāo)記探針。
第四是研究應(yīng)用本身的要求。如果研究SNP和基因突變，因?yàn)榻^大多數(shù)人類(lèi)基因是2態(tài)的，只存在兩種等位基因，2條探針已經(jīng)足夠。如果研究基因表達(dá)，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個(gè)內(nèi)對(duì)照，3色也就足夠了。
最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高數(shù)據(jù)精確度，二是節(jié)省反應(yīng)成本。同時(shí)測(cè)定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5種探針，就要同時(shí)加 入8-10條引物。在引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要考慮到盡量減少這些引物之間的競(jìng)爭(zhēng)和抑制等多種干擾，平衡各對(duì)引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的，但是要花 費(fèi)大量時(shí)間、人力和物力來(lái)篩選最佳引物組合、優(yōu)化反應(yīng)條件。如果實(shí)驗(yàn)規(guī)模不大，在總體上可能反而不合算。
在實(shí)際應(yīng)用中，不是單純追求加入的探針越多越好，而是追求總體效益的最優(yōu)化。比較切合實(shí)際的是2到3重反應(yīng)，引物和探針的設(shè)計(jì)不太困難，反應(yīng)條件的優(yōu)化也不太麻煩，同時(shí)降低了成本。
17. 等位基因鑒定實(shí)驗(yàn)（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不進(jìn)行ROX熒光校正？
不，等位基因鑒定實(shí)驗(yàn)也要進(jìn)行ROX熒光歸一，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密可靠。
由于試劑加樣操作的誤差、離心管熱量傳遞的誤差、離心管蓋透光性能的誤差等偶然因素是不可避免的，必然導(dǎo)致熒光激發(fā)效率的差異，因此儀器收集到的原始信號(hào)必須進(jìn)行歸一化校正，相互之間才可以比較并保證重現(xiàn)性。
這種校正是通過(guò)在反應(yīng)緩沖液中添加ROX校正熒光來(lái)實(shí)現(xiàn)的。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號(hào)的高低變化只與上述物理方面變化的總體效應(yīng)有關(guān)。將報(bào)告熒光的信號(hào)除以ROX熒光的信號(hào)，就能夠消除所有這些物理因素所引起的數(shù)據(jù)波動(dòng)。
18. 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法哪種數(shù)據(jù)更精密？
是同樣可靠的。內(nèi)標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的反應(yīng)條件最接近一致，缺點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針相互之間會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制，導(dǎo)致它們的 PCR效率有差異。外標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針之間沒(méi)有發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制的機(jī)會(huì)，但是不同管之間的反應(yīng)條件差異比同管的要大，也會(huì)導(dǎo)致它 們的PCR效率有差異。兩相比較，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的數(shù)據(jù)精確度是一樣的。
管壟13757341861： 如何利用數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)細(xì)胞某基因表達(dá)情況 -
武威市槽輪： ______ 一個(gè)良好的開(kāi)端就是分析感興趣基因的突變和其它異常,ICGC數(shù)據(jù)門(mén)戶(hù)提供了幾條研究路線.輸入一個(gè)基因名稱(chēng),NCBI登錄號(hào),或者Ensembl基因ID,點(diǎn)擊基因報(bào)告(Gene Report),就能在突變摘要(Mutation Summary)中找到已發(fā)現(xiàn)的突變和拷貝數(shù)變化,以及迄今為止,這些突變?cè)谀[瘤中出現(xiàn)的頻率.COSMICsection就在體細(xì)胞突變列表下方,包括了點(diǎn)突變,少量缺失,以及插入突變等方面的數(shù)據(jù).
管壟13757341861： 如何檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)中某基因的表達(dá) -
武威市槽輪： ______ 如何檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)中某基因的表達(dá) 首先要確認(rèn)目的基因已經(jīng)傳入受體細(xì)胞.然后再檢測(cè)其表達(dá)情況,一般有兩種方法:一個(gè)是通過(guò)特定性狀來(lái)判斷目的基因是否表達(dá),比如導(dǎo)入的目的基因是編碼某種酶的,那么最簡(jiǎn)便有效的方法就是經(jīng)過(guò)表達(dá)后檢測(cè)有沒(méi)有相應(yīng)酶的活力,同時(shí)跑蛋白膠,看有沒(méi)有預(yù)期的目的條帶,因?yàn)閷?duì)于酶來(lái)說(shuō),有時(shí)候目的基因雖然表達(dá)了,但是酶沒(méi)有活力,這時(shí)就不是表達(dá)的問(wèn)題了.另外一個(gè)就是利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白.
管壟13757341861： qPCR那些奇奇怪怪的曲線都代表啥 -
武威市槽輪： ______ 奇怪的曲線就代表基因擴(kuò)增的有問(wèn)題,可以檢測(cè)基因的表達(dá)量、模板質(zhì)量、引物有沒(méi)有降解等等,其次試劑本身的靈敏度也有關(guān)系.我用的是ChamQ SYBR qPCR Master Mix,靈敏度就很高,一年前我們實(shí)驗(yàn)室就開(kāi)始用了.
管壟13757341861： 如何開(kāi)展基因表達(dá)研究 -
武威市槽輪： ______ 摘要:眾所周知,在不同的情況下,在不同的組織中,基因表達(dá)的水平也不同.如今,研究人員可利用多種技術(shù)來(lái)追蹤基因表達(dá)水平的差異,如定量PCR、芯片或測(cè)序.對(duì)于這些技術(shù)平臺(tái),如何選擇?如何開(kāi)展數(shù)據(jù)分析和驗(yàn)證?且看看專(zhuān)家的回...
管壟13757341861： 已知克隆得到某一目的基因,如何得知該基因的功能 -
武威市槽輪： ______ 1. 去NCBI Blast 借助以往研究的積累,根據(jù)同源性和同源蛋白來(lái)預(yù)測(cè).然后看差異表達(dá)(比如,你發(fā)現(xiàn)該基因可能是免疫相關(guān),那么你可以對(duì)動(dòng)物進(jìn)行菌刺激看看該基因表達(dá)的差異).2. 構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng),做原核表達(dá),看看表達(dá)出來(lái)的蛋白,不過(guò)如果所得蛋白不是酶也基本弄不出個(gè)什么來(lái).
管壟13757341861： RT - PCR如何用來(lái)分析基因的時(shí)空表達(dá)? -
武威市槽輪： ______ 實(shí)時(shí)定量PCR,因?yàn)镽T-PCR過(guò)程中可以通過(guò)熒光標(biāo)記強(qiáng)弱分析基因的表達(dá)關(guān)系,表達(dá)量高的熒光強(qiáng).
管壟13757341861： 怎么研究基因啟動(dòng)子上游的一段序列是不是基因表達(dá)的調(diào)控序列 -
武威市槽輪： ______ 可以將序列克隆到體外進(jìn)行表達(dá),通過(guò)基因表達(dá)的量來(lái)進(jìn)行判斷: 1. 首先將上游序列帶啟動(dòng)子序列克隆到一些報(bào)告基因的載體中,例如luciferase的基因,首先觀察構(gòu)建后,luciferase是否能夠表達(dá).然后再通過(guò)突變或截短啟動(dòng)子上游的區(qū)域,來(lái)...
管壟13757341861： 如何預(yù)測(cè)和鑒定miRNA的靶基因 -
武威市槽輪： ______ 1. 創(chuàng)建miRNA模擬物.2. 將這些miRNA模擬物和pMirTrap載體共轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞,并孵育24小時(shí).同時(shí)利用miR-132、pMirTrap載體和pMirTrap對(duì)照載體開(kāi)展對(duì)照轉(zhuǎn)染.3. 利用附帶的MirTrap分離試劑盒裂解轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)物.4. 利用分...
管壟13757341861： 基因測(cè)序中一個(gè)反應(yīng)代表一個(gè)基因嗎 -
武威市槽輪： ______ 這個(gè)“反應(yīng)”一詞是從國(guó)外“reaction”一詞翻譯過(guò)來(lái)的.代表測(cè)序儀器進(jìn)行樣本處理一次的基本單位.通俗點(diǎn)講,就是測(cè)序儀對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行一次測(cè)序動(dòng)作的稱(chēng)呼.為什么要按反應(yīng)數(shù)來(lái)計(jì)算呢?很好理解:機(jī)器處理一次有固定成本,人工+折損+耗材,按反應(yīng)數(shù)便于商業(yè)化計(jì)算.
管壟13757341861： 分離一個(gè)基因上游啟動(dòng)子序列的最有效技術(shù)是什么 -
武威市槽輪： ______ 1.克隆含有該啟動(dòng)子的完整基因. 2.根據(jù)基因序列,設(shè)計(jì)引物,5'RACE. 3.報(bào)告基因融合篩選啟動(dòng)子.
1. MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix進(jìn)行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個(gè)槍頭加樣！
4. 所有成分加完后，離心去除氣泡。
5. 每個(gè)樣品至少3個(gè)平行孔。
參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊(cè)商標(biāo)了！）或者其他染料，只要不影響檢測(cè)PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量 反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線。現(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常來(lái)講，real-time qPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長(zhǎng)度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，加一個(gè)溶解程序，來(lái)形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特 異性擴(kuò)增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個(gè)在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時(shí)候，進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。
3. 儀器設(shè)置
所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時(shí)候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：
A. 首先是實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進(jìn)行“定量”實(shí)驗(yàn)。
B. 實(shí)驗(yàn)方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進(jìn)行。
C. 目的基因的設(shè)置：有幾個(gè)目的基因和目的基因的名稱(chēng)。
D. 樣品的設(shè)置：包括哪個(gè)是實(shí)驗(yàn)組，哪個(gè)是對(duì)照組。以及負(fù)對(duì)照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。
E. 對(duì)照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個(gè)是為后面的定量做準(zhǔn)備
F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是95℃15秒，60℃15秒的40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以。或者是儀器說(shuō)明書(shū)上建議的程序。
G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：
A-G這五個(gè)步驟簡(jiǎn)單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。
需要注意一點(diǎn)ABI儀器需要加ROX參比染料，默認(rèn)的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨(dú)分開(kāi)。要根據(jù)不 同公司的MasterMix進(jìn)行這一個(gè)步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒(méi)有參比染料，所以選擇“none”。
設(shè)置好之后，就可以把配置好的PCR管放進(jìn)儀器，點(diǎn)擊RUN！
五、Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析
1. Real-time qPCR常見(jiàn)參數(shù)
基線（baseline）
通常是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)
同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線
閾值（threshold）
自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍
手動(dòng)設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。
同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。
Ct值:與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。
分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）。
2.影響Ct值的關(guān)鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個(gè)合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間。
反應(yīng)液成分的影響
任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應(yīng)的效率
PCR反應(yīng)的效率也會(huì)影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會(huì)所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說(shuō)來(lái)，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。
3. 如何評(píng)估實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的效果
PCR擴(kuò)增效率：為了正確地評(píng)估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。
常見(jiàn)問(wèn)題
1. 無(wú)Ct值出現(xiàn)
檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。
引物或探針降解: 可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性。
模板量不足: 對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
模板降解: 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
2. Ct值出現(xiàn)過(guò)晚（Ct>38）
擴(kuò)增效率低: 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。
PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。
PCR產(chǎn)物太長(zhǎng): 一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳
加樣存在誤差: 使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。
標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解: 應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
引物或探針不佳: 重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針。
模板中存在抑制物，或模板濃度過(guò)高
4. 負(fù)對(duì)照有信號(hào)
引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
模板有基因組的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。
5. 溶解曲線不止一個(gè)主峰
引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。
模板有基因組的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。
6. 擴(kuò)增效率低
反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。
反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋?zhuān)偌尤敕磻?yīng)體系中，減少抑制物的影響。
7. 同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？
判斷標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增效率，靈敏度，特異性
如果擴(kuò)增效率在90%-110%，都是特異性擴(kuò)增，都可以把數(shù)據(jù)用于分析。
8. 擴(kuò)增曲線的異常？比如“S”型曲線？
參比染料設(shè)定不正確(MasterMix不加參比染料時(shí)，選NONE)
模板的濃度太高或者降解
熒光染料的降解
熒光定量PCR問(wèn)題匯總
1. 定量PCR儀的開(kāi)關(guān)機(jī)順序是怎樣的？
按照正確的開(kāi)關(guān)機(jī)順序操作，有助于延長(zhǎng)儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。
開(kāi)機(jī)順序：先開(kāi)電腦，待電腦完全啟動(dòng)后再開(kāi)啟定量PCR儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開(kāi)定量PCR的收集軟件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
關(guān)機(jī)順序：確認(rèn)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號(hào)收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機(jī)的電源，最后關(guān)閉電腦。
2. 哪些種類(lèi)的反應(yīng)管和蓋子適合定量PCR實(shí)驗(yàn)使用？有何需要注意的地方？
定量PCR實(shí)驗(yàn)可以使用以下耗材：96孔光學(xué)反應(yīng)板配合光學(xué)膜，0.2 ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合光學(xué)膜，0.2 ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合平蓋的光學(xué)八聯(lián)管蓋。ABI公司生產(chǎn)的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號(hào)見(jiàn)下表：
3. 為什么要定期對(duì)電腦進(jìn)行磁盤(pán)碎片整理？怎樣整理？
當(dāng)運(yùn)行實(shí)時(shí)定量PCR儀及使用軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)算機(jī)會(huì)刪除并創(chuàng)建若干文件，計(jì)算機(jī)硬盤(pán)的空閑空間會(huì)被分割成越來(lái)越多的小塊。當(dāng)硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器上文件以 分解的碎片存儲(chǔ)時(shí)，程序需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能存取文件，因?yàn)楸仨毝啻螌ふ椅募槠源嫒〔煌钠瑪唷Ｋ槠韺?shí)用程序?qū)⒁粋€(gè)文件分解開(kāi)的多個(gè)碎片合并在一 起，并存儲(chǔ)到硬盤(pán)的同一個(gè)位置，從而清除文件碎片，進(jìn)而優(yōu)化系統(tǒng)性能。
碎片整理的方法如下：
· 在Windows桌面上，選擇開(kāi)始(start)，我的電腦(My computer)。
· 在(我的電腦)窗口中，用鼠標(biāo)右鍵單擊硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器，并選擇(屬性)property。
· 在(屬性)對(duì)話框中選擇工具(Tools)選項(xiàng)卡，單擊開(kāi)始整理(Defragment now)。
· 單擊碎片整理(Defragment)。
· 當(dāng)顯示“碎片整理完畢”對(duì)話框時(shí)，單擊（確定）。
· 在“本地磁盤(pán)屬性”對(duì)話框中，單擊（確定）。
· 為計(jì)算機(jī)機(jī)中剩余的驅(qū)動(dòng)器重復(fù)如上步驟。
4. 何時(shí)執(zhí)行windows service pack更新？
不要執(zhí)行該操作。除非美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司代表通知您更新操作系統(tǒng)，否則請(qǐng)不要更新控制定量PCR 儀的計(jì)算機(jī)的操作系統(tǒng)。新版本的Microsoft Windows操作系統(tǒng)有可能與SDS 軟件存在沖突，并導(dǎo)致儀器不能正常運(yùn)行。如果您希望安裝service pack（更新包）以更新操作系統(tǒng)，應(yīng)查看隨SDS 軟件提供的版本說(shuō)明，避免兼容性問(wèn)題。
5. 應(yīng)該備份哪些數(shù)據(jù)？
應(yīng)該定期備份您的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，備份頻率推薦每周一次，用光盤(pán)刻錄。同時(shí)您也應(yīng)該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這些文件所在的目錄是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下圖是校正文件的樣本。
6.怎么樣的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境才能保證儀器設(shè)備正常運(yùn)行？
良好的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境有助于延長(zhǎng)儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個(gè)方面：
電源：推薦配備合適的UPS或穩(wěn)壓器。
通風(fēng)：儀器的通風(fēng)應(yīng)該沒(méi)有阻擋。
溫度：推薦實(shí)驗(yàn)室配備空調(diào)，溫度應(yīng)該控制在10-30°C之間。
濕度：20-80%；對(duì)于潮濕的省份，推薦實(shí)驗(yàn)室配備除濕機(jī)。
空間：易于操作，安全。
7. 怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？
一個(gè)辦法是運(yùn)行背景校正反應(yīng)板，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號(hào)，則表明該孔可能被熒光污染物。
另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行ROI的校正，當(dāng)某個(gè)孔的信號(hào)明顯高出其他孔時(shí)，則表明該孔被污染。
清除樣本加熱塊污染的步驟如下：
用移液器吸取少量乙醇并滴入每個(gè)污染的反應(yīng)孔中。
吹打數(shù)次。
將廢液吸入廢液杯中。
重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。
確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完。
8. 什么是背景校正？多長(zhǎng)時(shí)間執(zhí)行一次背景校正？
背景校正程序測(cè)量定量PCR儀所使用的反應(yīng)管和水的空白熒光強(qiáng)度。在運(yùn)行校正程序期間，定量PCR儀在10分鐘內(nèi)連續(xù)讀取背景校正板的熒光強(qiáng)度，信號(hào)收 集的溫度為60°C。隨后，SDS軟件計(jì)算所收集到的熒光強(qiáng)度的平均值，提取結(jié)果并保存到校正文件中。軟件在今后的分析中將自動(dòng)調(diào)用此校正文件，從實(shí)驗(yàn)數(shù) 據(jù)中扣除背景信號(hào)。
因?yàn)楸尘盁晒獾男盘?hào)強(qiáng)度隨著許多外界因素（比如外來(lái)的污染、反應(yīng)板/反應(yīng)管的生產(chǎn)廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進(jìn)行背景校正，一般每三個(gè)月到半年校正一次。
9. 什么是純熒光校正？多長(zhǎng)時(shí)間校正一次？
純熒光校正是測(cè)定各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的波長(zhǎng)和信號(hào)強(qiáng)度，通俗地說(shuō)是讓儀器“認(rèn)識(shí)”各種熒光染料。軟件收集并儲(chǔ)存各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信息。以后 每次定量實(shí)驗(yàn)運(yùn)行過(guò)程中，SDS軟件收集樣品的原始光譜信號(hào)，并將此原始光譜與純熒光文件中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，精確扣除不同染料的信號(hào)重疊部分，從而確定樣 品中的熒光染料種類(lèi)和信號(hào)強(qiáng)度。
推薦每半年進(jìn)行一次純熒光校正。在運(yùn)行光譜校正之前，請(qǐng)先進(jìn)行背景校正和ROI校正。
10.96孔板怎樣封膜？
當(dāng)使用96孔板做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，推薦使用光學(xué)膜代替蓋子來(lái)密封反應(yīng)孔。正確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然后橫向，最后沿著板的邊緣按壓使之密封。
11.使用單管或8連管做實(shí)驗(yàn)時(shí)，在樣品加熱塊上應(yīng)該怎樣安排放置？
使用單管或8連管做實(shí)驗(yàn)，并且樣本數(shù)量不多的時(shí)候，建議在樣品加熱塊(TRAY)上對(duì)稱(chēng)地安放樣品，最好是縱向放置，并且優(yōu)先放在第6列或第7列，然后 逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來(lái)的時(shí)候不至于發(fā)生傾斜，各個(gè)反應(yīng)管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的數(shù)據(jù)精密性.
12. 絕對(duì)定量與相對(duì)定量有什么區(qū)別？
絕對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說(shuō)的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。
舉例來(lái)說(shuō)，如果研究項(xiàng)目中包括處理過(guò)的和未經(jīng)處理的對(duì)照樣本，通常可以將未經(jīng)處理的樣本指定為基準(zhǔn)，規(guī)定其目的基因濃度為100%，將經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果除以對(duì)照樣品的定量結(jié)果，就可以計(jì)算各個(gè)處理樣本的基因含量相對(duì)于未處理樣品的百分比。
絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為 簡(jiǎn)便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個(gè)已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。
CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對(duì)數(shù)成反比的數(shù)學(xué)關(guān)系，來(lái)計(jì)算不同樣本之間的相對(duì)百分比，其計(jì)算公式是。
絕對(duì)定量的數(shù)據(jù)易于理解，但是絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的制備和測(cè)定其DNA含量比較困難。有許多商業(yè)性的標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒供選購(gòu)，可以解決這種困難。
相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品容易在實(shí)驗(yàn)室里自己制備，但是數(shù)據(jù)處理比較麻煩，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的解釋有一定難度。
13. 定量PCR基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？
總的來(lái)說(shuō)，有三個(gè)層次的校正是必須要做的。
首先，參比信號(hào)校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由于反應(yīng)總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的 熒光信號(hào)波動(dòng)都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映PCR進(jìn)程。ROX校正能夠極大地改進(jìn)定量的精確度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。
其次，內(nèi)對(duì)照校正。實(shí)驗(yàn)中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來(lái)自不同數(shù)目的細(xì)胞，所以將實(shí)驗(yàn)結(jié)果校正到每個(gè)細(xì)胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同時(shí)定量一個(gè)內(nèi)對(duì)照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S。內(nèi)對(duì)照校正使不同樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以相互比較。
第三，計(jì)算相對(duì)于基準(zhǔn)樣品(Calibrator)的相對(duì)基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時(shí)和6小時(shí)的、正常和患病的之間的基因表達(dá)的差別，則需要計(jì)算處理/未處理、6小時(shí)/0小時(shí)、患病/正常。
14. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對(duì)定量的數(shù)據(jù)應(yīng)該怎么處理？
假設(shè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時(shí)IL-2基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用的內(nèi)對(duì)照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測(cè)定結(jié)果都是總RNA的pg數(shù)，數(shù)據(jù)的處理方法見(jiàn)下表：
15.什么是CT值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？
CT值與起始DNA濃度的對(duì)數(shù)成反比：
如果(1)不同管之間的PCR反應(yīng)效率相同；(2)這些PCR的反應(yīng)效率接近100%，可以從上面的公式推出相對(duì)含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假設(shè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時(shí)IL-2基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用內(nèi)對(duì)照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測(cè)定結(jié)果都是CT值，而沒(méi)有通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總RNA的pg數(shù)。
16. 每個(gè)反應(yīng)管中可以加入多少種探針？
每個(gè)反應(yīng)管中可以加入的探針數(shù)目，取決于儀器、軟件、試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等幾個(gè)方面。
首先是儀器的硬件構(gòu)成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下，全波長(zhǎng)檢測(cè)的定量PCR儀如激光管-CCD類(lèi)型對(duì)于探針的數(shù)量實(shí)際上是沒(méi)有限制 的。如果信號(hào)的采集要通過(guò)濾色片，那么探針的數(shù)量取決于濾色片的數(shù)目，增加探針需要增加或改變?yōu)V色片。改動(dòng)儀器的結(jié)構(gòu)通常很困難。以AB公司的儀器為 例，7900和7700是激光-全波長(zhǎng)檢測(cè)的，7000、7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。
其次是化學(xué)上的可能性。不同的熒光基團(tuán)要組合到一起，在同一反應(yīng)管內(nèi)使用，必須其激發(fā)波長(zhǎng)既相對(duì)靠近又不能靠得太近，既保證信號(hào)激發(fā)的效率又保證信號(hào)不 重疊干擾，能夠區(qū)分清楚。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的熒光基團(tuán)種類(lèi)有限，滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達(dá)到每組4到5種熒光的水平。
第三是實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和選用的探針類(lèi)型。定量PCR實(shí)驗(yàn)必須使用ROX校正熒光，占去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(tuán)(TAMRA)也要占用一種 熒光，對(duì)于4色檢測(cè)的儀器來(lái)說(shuō)，只剩下2種熒光可以標(biāo)記探針，對(duì)于5色檢測(cè)的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針，由于它的淬滅基團(tuán)是不發(fā)熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標(biāo)記探針。如果實(shí)驗(yàn)要求不高，不做ROX校正（AB公司不推薦這樣 做），還可以再多一種熒光用于標(biāo)記探針。
第四是研究應(yīng)用本身的要求。如果研究SNP和基因突變，因?yàn)榻^大多數(shù)人類(lèi)基因是2態(tài)的，只存在兩種等位基因，2條探針已經(jīng)足夠。如果研究基因表達(dá)，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個(gè)內(nèi)對(duì)照，3色也就足夠了。
最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高數(shù)據(jù)精確度，二是節(jié)省反應(yīng)成本。同時(shí)測(cè)定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5種探針，就要同時(shí)加 入8-10條引物。在引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要考慮到盡量減少這些引物之間的競(jìng)爭(zhēng)和抑制等多種干擾，平衡各對(duì)引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的，但是要花 費(fèi)大量時(shí)間、人力和物力來(lái)篩選最佳引物組合、優(yōu)化反應(yīng)條件。如果實(shí)驗(yàn)規(guī)模不大，在總體上可能反而不合算。
在實(shí)際應(yīng)用中，不是單純追求加入的探針越多越好，而是追求總體效益的最優(yōu)化。比較切合實(shí)際的是2到3重反應(yīng)，引物和探針的設(shè)計(jì)不太困難，反應(yīng)條件的優(yōu)化也不太麻煩，同時(shí)降低了成本。
17. 等位基因鑒定實(shí)驗(yàn)（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不進(jìn)行ROX熒光校正？
不，等位基因鑒定實(shí)驗(yàn)也要進(jìn)行ROX熒光歸一，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密可靠。
由于試劑加樣操作的誤差、離心管熱量傳遞的誤差、離心管蓋透光性能的誤差等偶然因素是不可避免的，必然導(dǎo)致熒光激發(fā)效率的差異，因此儀器收集到的原始信號(hào)必須進(jìn)行歸一化校正，相互之間才可以比較并保證重現(xiàn)性。
這種校正是通過(guò)在反應(yīng)緩沖液中添加ROX校正熒光來(lái)實(shí)現(xiàn)的。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號(hào)的高低變化只與上述物理方面變化的總體效應(yīng)有關(guān)。將報(bào)告熒光的信號(hào)除以ROX熒光的信號(hào)，就能夠消除所有這些物理因素所引起的數(shù)據(jù)波動(dòng)。
18. 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法哪種數(shù)據(jù)更精密？
是同樣可靠的。內(nèi)標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的反應(yīng)條件最接近一致，缺點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針相互之間會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制，導(dǎo)致它們的 PCR效率有差異。外標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針之間沒(méi)有發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制的機(jī)會(huì)，但是不同管之間的反應(yīng)條件差異比同管的要大，也會(huì)導(dǎo)致它 們的PCR效率有差異。兩相比較，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的數(shù)據(jù)精確度是一樣的。
什么因素導(dǎo)致QPCR中擴(kuò)增曲線無(wú)法達(dá)到平臺(tái)期?
在QPCR實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)增曲線無(wú)法達(dá)到平臺(tái)期的原因可能包含基因豐度低和循環(huán)數(shù)較少這兩個(gè)重要因素。當(dāng)基因豐度較低時(shí)，意味著樣本中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)相對(duì)較少，這會(huì)導(dǎo)致在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，達(dá)到特定模板濃度所需的時(shí)間更長(zhǎng)，從而可能無(wú)法形成穩(wěn)定的平臺(tái)期。解決這個(gè)問(wèn)題的策略之一是增加循環(huán)數(shù)，即增加PCR擴(kuò)增的循環(huán)...
如何穩(wěn)定敲低特定的miRNA
不過(guò)，體內(nèi)miRNA的隔離不會(huì)總是讓miRNA豐度下降。另一個(gè)方法是用報(bào)告基因重組子來(lái)監(jiān)控miRNA的抑制。miRNA會(huì)抑制報(bào)告基因的表達(dá)，除非它的活性受阻。當(dāng)然，這種報(bào)告基因的使用一般受限于細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。Silvia Monticelli（瑞士生物醫(yī)學(xué)研究所）這些實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵一步是：通過(guò)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，你有效地改變了它們，...
qpcr曲線異常什么原因?擴(kuò)增曲線平臺(tái)期下降?
在RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)增曲線異常是常見(jiàn)的問(wèn)題，包括Ct值偏大、平臺(tái)期下降、曲線平臺(tái)期鋸齒狀、無(wú)平臺(tái)期、熔解曲線異常等。針對(duì)這些問(wèn)題，可以采取不同的解決方案。當(dāng)Ct值偏大時(shí)，可能是模板量低或基因表達(dá)豐度低，建議增加模板量或優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，確保擴(kuò)增效率。若平臺(tái)期下降，可能是基線范圍設(shè)置不當(dāng)，此時(shí)...
什么是ChIP?——ChIP原理概述
染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)是一種研究蛋白-DNA相互作用的技術(shù)，通過(guò)利用抗體選擇性地捕獲結(jié)合蛋白及其DNA靶標(biāo)，為染色質(zhì)狀態(tài)和基因表達(dá)調(diào)控提供信息。ChIP技術(shù)結(jié)合了蛋白質(zhì)組分析與分子生物學(xué)技術(shù)，適用于多種研究，包括比較蛋白在不同位點(diǎn)的豐度、繪制特定基因組區(qū)域的蛋白圖以及定量刺激后結(jié)合誘導(dǎo)基因的蛋白。
m6A都有哪些相關(guān)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?來(lái)看一下吧
比如，可以 利用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D抑制細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄后 ，在不同時(shí)間點(diǎn)收集總RNA，然后做 Northern或者RT-PCR ，比較不同時(shí)間點(diǎn)mRNA豐度的變化。如下圖，Boxuan Simen Zhao.在“Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications”一文中通過(guò)半衰期講述m6A修飾對(duì)mRNA穩(wěn)定性的影響。除了一系列...
ALKBH5通過(guò)m6A-dependent表觀遺傳沉默pre-miR-181b-1\/YAP信號(hào)軸抑制骨...
有趣的是,根據(jù)基于序列的m6A修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http:\/\/www.cuilab.cn\/ SRAMP),作者觀察到Y(jié)AP基因的mRNA攜帶9個(gè)潛在的m6A修飾位點(diǎn)。接下來(lái)作者驗(yàn)證了ALKBH5是否可以直接調(diào)控YAP的m6A甲基化和基因降解。采用基因特異性m6A-qPCR檢測(cè)YAP的表達(dá)。過(guò)表達(dá)ALKBH5后,m6A- RIP組YAP mRNA中m6A豐度明顯降低,IgG-RIP組未見(jiàn)明顯...
小知識(shí) | 了解逆轉(zhuǎn)錄,獲得高質(zhì)量cDNA(一)
選擇合適的逆轉(zhuǎn)錄酶，確保高質(zhì)量的cDNA合成，對(duì)RT-qPCR的成功至關(guān)重要。在構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)，高效逆轉(zhuǎn)錄酶捕獲低豐度RNA，提供基因時(shí)空表達(dá)信息。RACE（cDNA末端快速擴(kuò)增）用于確定未知序列的5'和3'末端，逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。RNA測(cè)序（RNA-Seq）是一種高通量方法，用于分析轉(zhuǎn)錄組，逆轉(zhuǎn)錄步驟捕獲...
國(guó)自然標(biāo)書(shū)中技術(shù)路線圖的4種繪制邏輯!
檢測(cè)DNA拷貝數(shù)、突變與否的技術(shù)（FISH原位雜交、qPCR、基因組測(cè)序等）、檢測(cè)RNA分子在組織和細(xì)胞空間分布和表達(dá)豐度的技術(shù)（活細(xì)胞動(dòng)態(tài)RNA成像技術(shù)、單分子RNA FISH原位雜交、多分子RNA Scope原位雜交技術(shù)、細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)分離結(jié)合qPCR、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)、空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)、Northern blot、dot blot等）、分子表達(dá)...
QPCR中擴(kuò)增曲線無(wú)法達(dá)到平臺(tái)期怎么辦?
在QPCR實(shí)驗(yàn)中遇到擴(kuò)增曲線無(wú)法達(dá)到平臺(tái)期的問(wèn)題，這通常意味著基因豐度較低或循環(huán)數(shù)較少。為了解決這一問(wèn)題，可以采取以下措施：首先，增加循環(huán)數(shù)是解決此問(wèn)題的有效方法之一。通過(guò)延長(zhǎng)擴(kuò)增循環(huán)的時(shí)間，可以為PCR反應(yīng)提供更多機(jī)會(huì)達(dá)到擴(kuò)增曲線的平臺(tái)期。然而，應(yīng)注意避免過(guò)度延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間，以防止非特異性產(chǎn)物的...
科研其實(shí)很簡(jiǎn)單,一文幫你搞懂ChIP
ChIP的核心原理是，首先通過(guò)甲醛將目標(biāo)蛋白與DNA結(jié)合，接著通過(guò)超聲或酶切技術(shù)將染色質(zhì)片段化，然后利用抗體特異性地免疫沉淀目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA片段。這些片段經(jīng)過(guò)純化后，可以進(jìn)行如ChIP-qPCR定量分析，測(cè)定特定區(qū)域蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA豐度，或者通過(guò)ChIP-Seq技術(shù)，進(jìn)行全基因組范圍的互作區(qū)段分析。ChIP的優(yōu)勢(shì)...
相關(guān)評(píng)說(shuō)：
武威市槽輪： ______ 一個(gè)良好的開(kāi)端就是分析感興趣基因的突變和其它異常,ICGC數(shù)據(jù)門(mén)戶(hù)提供了幾條研究路線.輸入一個(gè)基因名稱(chēng),NCBI登錄號(hào),或者Ensembl基因ID,點(diǎn)擊基因報(bào)告(Gene Report),就能在突變摘要(Mutation Summary)中找到已發(fā)現(xiàn)的突變和拷貝數(shù)變化,以及迄今為止,這些突變?cè)谀[瘤中出現(xiàn)的頻率.COSMICsection就在體細(xì)胞突變列表下方,包括了點(diǎn)突變,少量缺失,以及插入突變等方面的數(shù)據(jù).
武威市槽輪： ______ 如何檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)中某基因的表達(dá) 首先要確認(rèn)目的基因已經(jīng)傳入受體細(xì)胞.然后再檢測(cè)其表達(dá)情況,一般有兩種方法:一個(gè)是通過(guò)特定性狀來(lái)判斷目的基因是否表達(dá),比如導(dǎo)入的目的基因是編碼某種酶的,那么最簡(jiǎn)便有效的方法就是經(jīng)過(guò)表達(dá)后檢測(cè)有沒(méi)有相應(yīng)酶的活力,同時(shí)跑蛋白膠,看有沒(méi)有預(yù)期的目的條帶,因?yàn)閷?duì)于酶來(lái)說(shuō),有時(shí)候目的基因雖然表達(dá)了,但是酶沒(méi)有活力,這時(shí)就不是表達(dá)的問(wèn)題了.另外一個(gè)就是利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白.
武威市槽輪： ______ 奇怪的曲線就代表基因擴(kuò)增的有問(wèn)題,可以檢測(cè)基因的表達(dá)量、模板質(zhì)量、引物有沒(méi)有降解等等,其次試劑本身的靈敏度也有關(guān)系.我用的是ChamQ SYBR qPCR Master Mix,靈敏度就很高,一年前我們實(shí)驗(yàn)室就開(kāi)始用了.
武威市槽輪： ______ 摘要:眾所周知,在不同的情況下,在不同的組織中,基因表達(dá)的水平也不同.如今,研究人員可利用多種技術(shù)來(lái)追蹤基因表達(dá)水平的差異,如定量PCR、芯片或測(cè)序.對(duì)于這些技術(shù)平臺(tái),如何選擇?如何開(kāi)展數(shù)據(jù)分析和驗(yàn)證?且看看專(zhuān)家的回...
武威市槽輪： ______ 1. 去NCBI Blast 借助以往研究的積累,根據(jù)同源性和同源蛋白來(lái)預(yù)測(cè).然后看差異表達(dá)(比如,你發(fā)現(xiàn)該基因可能是免疫相關(guān),那么你可以對(duì)動(dòng)物進(jìn)行菌刺激看看該基因表達(dá)的差異).2. 構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng),做原核表達(dá),看看表達(dá)出來(lái)的蛋白,不過(guò)如果所得蛋白不是酶也基本弄不出個(gè)什么來(lái).
武威市槽輪： ______ 實(shí)時(shí)定量PCR,因?yàn)镽T-PCR過(guò)程中可以通過(guò)熒光標(biāo)記強(qiáng)弱分析基因的表達(dá)關(guān)系,表達(dá)量高的熒光強(qiáng).
武威市槽輪： ______ 可以將序列克隆到體外進(jìn)行表達(dá),通過(guò)基因表達(dá)的量來(lái)進(jìn)行判斷: 1. 首先將上游序列帶啟動(dòng)子序列克隆到一些報(bào)告基因的載體中,例如luciferase的基因,首先觀察構(gòu)建后,luciferase是否能夠表達(dá).然后再通過(guò)突變或截短啟動(dòng)子上游的區(qū)域,來(lái)...
武威市槽輪： ______ 1. 創(chuàng)建miRNA模擬物.2. 將這些miRNA模擬物和pMirTrap載體共轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞,并孵育24小時(shí).同時(shí)利用miR-132、pMirTrap載體和pMirTrap對(duì)照載體開(kāi)展對(duì)照轉(zhuǎn)染.3. 利用附帶的MirTrap分離試劑盒裂解轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)物.4. 利用分...
武威市槽輪： ______ 這個(gè)“反應(yīng)”一詞是從國(guó)外“reaction”一詞翻譯過(guò)來(lái)的.代表測(cè)序儀器進(jìn)行樣本處理一次的基本單位.通俗點(diǎn)講,就是測(cè)序儀對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行一次測(cè)序動(dòng)作的稱(chēng)呼.為什么要按反應(yīng)數(shù)來(lái)計(jì)算呢?很好理解:機(jī)器處理一次有固定成本,人工+折損+耗材,按反應(yīng)數(shù)便于商業(yè)化計(jì)算.
武威市槽輪： ______ 1.克隆含有該啟動(dòng)子的完整基因. 2.根據(jù)基因序列,設(shè)計(jì)引物,5'RACE. 3.報(bào)告基因融合篩選啟動(dòng)子.
