聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)體系
聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一個關(guān)鍵的分子生物學(xué)技術(shù)，其反應(yīng)體系包含以下幾個主要成分：
- 緩沖液：通常pH為7.2，含有Mg2+，如1.5mmol/L。選擇適當(dāng)?shù)木彌_液如Tris-HCl（pH7.6）和KCl濃度，對反應(yīng)結(jié)果影響較大。
- 模板DNA：經(jīng)過預(yù)處理的單鏈或雙鏈DNA/RNA，純度要求高，高分子量DNA處理后效果更佳。
- 引物：設(shè)計成16-30bp長，與目標(biāo)序列互補，避免內(nèi)部結(jié)構(gòu)和互補，退火溫度需通過計算確定（Ta = Tm - 5℃）。
- Taq DNA聚合酶：耐高溫型，由Thermusaquatics分離，74-75℃最適溫度，Mg2+濃度對酶活性至關(guān)重要。
反應(yīng)條件包括：Mg2+濃度（1-10mmol/L），dNTPs濃度（40-200μmol/L），引物濃度（0.1-1μmol/L），以及酶用量（如2.5U/μl）。電泳分析常用瓊脂糖凝膠進行產(chǎn)物檢測。
PCR的關(guān)鍵在于溫度循環(huán)，包括變性（90-95℃）、退火（根據(jù)引物調(diào)整）和延伸（70-75℃）階段。通過調(diào)整這些參數(shù)，可以優(yōu)化特異性、產(chǎn)量和擴增效率。底物抑制（0%）和低dNTP濃度有助于提高產(chǎn)物質(zhì)量和擴增效率。
影響PCR特異性和結(jié)果的因素還包括模板質(zhì)量、引物設(shè)計、緩沖液成分和濃度，以及反應(yīng)循環(huán)次數(shù)等。在擴增后期，增速減緩可能由多種因素導(dǎo)致，需要根據(jù)具體情況進行細(xì)致調(diào)整，以優(yōu)化PCR反應(yīng)性能。
擴展資料
聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），又稱無細(xì)胞克隆技術(shù)(“free bacteria”cloning technique)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法。1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。該方法一改傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的模式，不通過活細(xì)胞，操作簡便，在數(shù)小時內(nèi)可使幾個拷貝的模板序列甚至一個DNA分子擴增10^7～10^8倍，大大提高了DNA的得率。已廣泛應(yīng)用到分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。
聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)體系
聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一個關(guān)鍵的分子生物學(xué)技術(shù)，其反應(yīng)體系包含以下幾個主要成分：緩沖液：通常pH為7.2，含有Mg2+，如1.5mmol\/L。選擇適當(dāng)?shù)木彌_液如Tris-HCl（pH7.6）和KCl濃度，對反應(yīng)結(jié)果影響較大。模板DNA：經(jīng)過預(yù)處理的單鏈或雙鏈DNA\/RNA，純度要求高，高分子量DNA處理后效果更佳。引物：...
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系
酶：主要為Taq和Pfu，作為PCR反應(yīng)的關(guān)鍵催化劑。緩沖液：含有緩沖體系（如HEPES或MOPS）、一價陽離子（如鉀離子）、二價陽離子（Mg2+）和輔助成分，如DMSO、甘油等，以維持酶活性和DNA結(jié)構(gòu)。Mg2+：維持反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋。引物設(shè)計是PCR的重要步驟，通常需要兩個引物，5'端引物與...
聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)體系
在典型的PCR反應(yīng)體系中，需要加入適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2+和兩個合成的DNA引物。模板DNA在94℃下變性1分鐘，然后在40～60℃下與引物退火1分鐘，最后在72℃下延伸2分鐘。在首次循環(huán)前，模板需要預(yù)變性3～5分鐘；在末次循環(huán)后，樣品仍需繼續(xù)延伸3～5分鐘以上，以...
PCR聚合酶鏈反應(yīng)體系有何特點?
聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種在體外進行的DNA擴增技術(shù)，具有高效、快速、特異性高的特點。PCR體系主要包括DNA模板、引物、dNTPs、緩沖液、耐熱聚合酶和Mg2+等。在PCR體系中，DNA模板是反應(yīng)的起點，而引物則是特定序列，用以引導(dǎo)DNA聚合酶合成新鏈。引物的特異性保證了反應(yīng)只在目標(biāo)序列上發(fā)生，避免了非特異...
聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)體系
在一個典型的PCR反應(yīng)體系中需加入:適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2 和兩個合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min,引物與模板40～60℃退火1min,72℃延伸2min。在首次循環(huán)前模板預(yù)變性3～5min;在末次循環(huán)后,樣品仍需繼續(xù)延伸3～5min以上,確保擴增的DNA為雙鏈DNA。為便于了解PCR反應(yīng)...
PCR操作范例及反應(yīng)體系的組成是什么?
PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）是一種在體外快速擴增DNA片段的技術(shù)，其操作范例及反應(yīng)體系主要包含以下部分：首先，準(zhǔn)備DNA模板，這可以根據(jù)實驗需要選擇特定的DNA樣本；其次，設(shè)計特異性引物，引物是PCR反應(yīng)中關(guān)鍵的分子，其序列需要與DNA模板的特定區(qū)域互補；接著，加入適量的多聚酶，如Taq酶，用于催化DNA鏈的延伸；...
PCR--聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基本原理和概念
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是在試管中進行DNA復(fù)制反應(yīng),基本原理與體內(nèi)相似,不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶,用合成的DNA引物替代RNA引物,用加熱、冷卻等改變溫度的辦法使DNA得以復(fù)制,反復(fù)進行變性、退火、延伸循環(huán),就可使DNA無限擴增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的具體過程如下: 將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系升溫至95℃左右,雙鏈的DNA模板就...
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的準(zhǔn)備有哪些?
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是現(xiàn)代生物學(xué)研究中的一項重要技術(shù)，用于擴增特定的DNA序列。在進行PCR實驗之前，需要準(zhǔn)備一個合適的反應(yīng)體系。該體系主要包含以下成分：10×擴增緩沖液：提供PCR所需的適宜pH值和離子環(huán)境，以及維持DNA聚合酶活性所需的輔助成分。4種dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）混合物：在PCR過程中，...
聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)基本原理
聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是模擬DNA自然復(fù)制過程的一種體外擴增特定DNA片段的高效技術(shù)。其原理基于DNA變性和復(fù)性的基本原理。在PCR過程中，首先，引物按照堿基配對原則與DNA模板互補結(jié)合。然后，在DNA多聚酶的作用下，從引物開始合成與模板DNA互補的DNA鏈。這一過程遵循堿基配對原則（A與T配對，C與G配對）...
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)詳細(xì)實驗操作步驟
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是一種在體外進行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴增反應(yīng)。其原理是在特定條件下，依賴于DNA聚合酶催化，以模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當(dāng)濃度的Mg2+為原料進行DNA擴增。兩個引物分別與模板DNA的兩端互補結(jié)合，限定擴增片段。PCR反應(yīng)由變性→退火→延伸循環(huán)構(gòu)成，即在高溫...
相關(guān)評說：
佛岡縣中心： ______[答案] PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的 天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物.PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加 熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形...
佛岡縣中心： ______ (PCR)1985年,美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室Mullis等 人發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),使人們夢寐以 求的體外大量擴增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實.之后,該技術(shù) 應(yīng)用到了疾病診斷方法中.Moliter等(1991)根據(jù)PPV基因 組序列設(shè)計了 1對引物,擴增VP2基因中158 bP的片段,利 用酶切和探針雜交證實了擴增產(chǎn)物的特異性,同時對4株 PPV及CPV、PRV(豬偽狂犬病病毒)的擴增結(jié)果進一步證實了 PCR反應(yīng)的特異性,該方法至少可以檢出100 fg的 PPVDNA,相當(dāng)于1PFU(空斑形成單位)的PPV量.
佛岡縣中心： ______ DNA,DNA復(fù)制到時候需要一段RNA分子作為引物
佛岡縣中心： ______ PCR,即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).PCR技術(shù)就是在體外的小試管中,通過酶促反應(yīng)有選擇的大量擴增特定DNA片段的技術(shù),在PCR反應(yīng)體系中加入作為模板的DNA序列與計劃獲得的目的基因雙鏈各一端序列相互補的兩個DNA引物,TaqDNA聚合酶和四種脫氧核糖核苷酸.在高溫95℃下作為模板的雙鏈DNA解旋成為單鏈DNA,反應(yīng)體系溫度降低至55°時,引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合,當(dāng)反應(yīng)體系溫度回升至72℃時,DNA聚合酶以目的基因為模板,將四種脫氧核糖核苷酸逐個按照堿基互補配對原則連接在引物之后,使合成的新鏈延伸,形成互補的DNA雙鏈,如此進行多個循環(huán),就可以有選擇的大量擴增需要的DNA片段.這樣就是PCR技術(shù)中基因增加的方式.
佛岡縣中心： ______ 細(xì)胞按要求培養(yǎng),抽RNA, 反轉(zhuǎn)錄為cDNA.有細(xì)胞計數(shù),測RNA 濃度(分光光度計)等環(huán)節(jié).選擇反應(yīng)物,待測樣本:0hr, P4, L4, P12, L12, P24, L24, P36, L36 九種 陰性對照:即無模板對照, NTC 作為標(biāo)準(zhǔn)的樣品:如果有必要做標(biāo)準(zhǔn)曲線...
佛岡縣中心： ______ PCR-RFLP是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接的限制性片段長度多態(tài)性分析的簡稱.是在 PCR 和 DNA 序列分析基礎(chǔ)上產(chǎn)生的 RFLP 技術(shù).該方法是通過 PCR 擴增一段 DNA 片段,然后再選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶,消化 PCR 產(chǎn)物,經(jīng)電泳,可得到有特異性的電泳譜帶,從而達(dá)到鑒定不同基因型的目的.
佛岡縣中心： ______ 模板即擴增用的DNA,可以是任何來源,但有兩個原則,第一純度必須較高,第二濃度不能太高以免抑制緩沖液的成分最為復(fù)雜,除水外一般包括四個有效成分:緩沖體系,一般使用HEPES或MOPS緩沖體系;一價陽離子,一般采用鉀離子,但在特殊情況下也可使用銨根離子;二價陽離子,即鎂離子,根據(jù)反應(yīng)體系確定,除特殊情況外不需調(diào)整;輔助成分,常見的有DMSO、甘油等,主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR引物設(shè)計PCR反應(yīng)中有兩條引物,即5′端引物和3′引物
